2021-09-07
期刊：《Genomics》
影響因子：5.73
文章題目：Long noncoding RNA and mRNA profiling of hypothalamic-pituitarymammary gland axis in lactating sows under heat stress
技術手段：RNA-seq，qRT-PCR
派森諾生物與浙江大學攜手合作，于近期在《Genomics》上發(fā)表了lncRNA轉錄組分析揭示泌乳母豬熱應激的分子反應。
熱應激(Heat stress, HS)嚴重影響母豬泌乳性能，然而，關于HS通過下丘腦-垂體-乳腺軸(HPMA)影響雌性動物泌乳性能的機制，信息有限。長鏈非編碼RNA (Long non-coding RNAs, lncRNAs)在轉錄和轉錄后調控中發(fā)揮重要作用。但是，lncRNA在母豬下丘腦-垂體-乳腺軸上表達影響泌乳性能的機制尚不清楚。因此，本研究對熱應激和熱舒適條件下哺乳母豬的下丘腦、垂體和乳腺組織進行了RNA測序和生物信息學分析，結合轉錄組分析揭示HPMA對HS的響應機制，探討熱應激誘導哺乳期母豬泌乳的深層次原因。
技術路線
研究結果
HPMA（下丘腦-垂體-乳腺軸）中的鑒定表達分析
使用|log2Fold Change| > 1和Pvalue <0.05作為差異基因篩選標準，分別在不同處理下的下丘腦、垂體和乳腺，鑒定到差異表達的mRNA和lncRNA，并通過venn圖，展示下丘腦、垂體和乳腺在熱應激下共有的差異表達基因(圖1)。聚類分析確定HS和TC條件下DE lncRNA和DE mRNA的表達模式，DE LncRNA和DE mRNA的熱圖顯示三個組織中TC組和HS組分別明顯分離(圖2)。
圖1 HS組和TC組之間HPMA中的DE lncRNA（圖1 A）和DE mRNA（圖1 B）
圖2 HS組和TC組之間HPMA組織中DE lncRNA（圖A）和DE mRNA（圖B）的熱圖
本研究主要從激素基因、乳蛋白相關基因和熱休克蛋白3個方面對HPMA調控母豬泌乳過程的可能途徑進行研究。激素基因方面，HS組下丘腦GHRH、泌乳素釋放激素(PRLH)、PRL受體(PRLR)表達顯著下調(P < 0.01)。垂體PRL和卵泡刺激素受體(FSHR)的表達下調(P < 0.01)，而GH的表達不受影響。HS組乳腺GH受體(GHR)表達顯著上調(P < 0.01)， IGF-1表達顯著下調(P < 0.01)。此外，Csn2表達上調(P < 0.05)，Csnk1g3表達下調(P < 0.01)，而Csn1s1、Csn3等乳蛋白相關基因在乳腺中的表達在兩組間無顯著差異。通過RNA測序，分別在垂體和乳腺中發(fā)現(xiàn)編碼熱休克蛋白的19和25個DE mRNA，包括編碼Hsp10、Hsp40、Hsp60、Hsp70、Hsp90和Hsp110的基因。HS組Hsp90aa1、Hspa4l、Hspa4等大部分基因表達顯著上調(P <0.01)。
富集分析
在下丘腦、垂體和乳腺中差異表達的lncRNA，分別預測到129、33和33個潛在的順式靶基因，對這些靶基因進行GO和KEGG富集分析（圖3）。同時，對差異表達的mRNA也分別進行了GO和KEGG富集分析。
圖3 (A-B)下丘腦DE lncRNA靶基因的GO和KEGG富集分析;(C-D)垂體DE lncRNA靶基因的GO和KEGG富集分析; (E-F)乳腺DE lncRNA靶基因的GO和KEGG富集分析
lncRNA-mRNA共表達網絡的構建
通過構建基因共表達網絡，鑒定DE lncRNA與DE mRNA之間的相互作用。下丘腦中只有兩個DE lncRNAs (MSTRG.16623.2, ENSSSCT00000057567)與mRNA (ENSSSCG00000003650, ENSSSCG00000034396)呈負相關。垂體和乳腺中DE lncRNAs和DE mRNA的相關性分別為60對和86對，其中50對和72對為正相關，10對和14對為負相關(圖4)。在垂體和乳腺中分別有10和6個DE mRNA與不止一個DE lncRNA相互作用。其中，在乳腺中mRNA (ENSSSCG00000008954)與8種不同DE lncRNA呈顯著正相關。
圖4 lncRNA與mRNA在垂體（圖4 A）和乳腺（圖4 B）的共表達網絡；紅色代表上調，綠色代表下調
qPCR驗證
從下丘腦、垂體和乳腺中隨機選取3個DE lncRNA和3個DE mRNA進行qPCR，驗證其差異表達(圖5)，結果與測序數據一致。
圖5分別為下丘腦、垂體和乳腺DE lncRNA和DE mRNA的qPCR驗證結果
結論
本研究采用RNA-seq對HS泌乳母豬的下丘腦、垂體和乳腺組織進行分析，發(fā)現(xiàn)各組織大規(guī)模的轉錄變化參與了對HS的適應性反應。HS可降低下丘腦功能及相關激素(GHRH、PRLH、PRL)的表達，并可激活POA的熱敏神經元，影響采食量。母豬的垂體在HS期間處于高能量消耗狀態(tài)，可能導致垂體能量平衡負，內分泌紊亂。此外，HS在哺乳過程中可能導致乳腺缺氧，影響細胞存活，增加細胞間緊密連接的通透性。HS影響Hsps在hpma相關組織中的表達，可能消耗能量儲備，降低泌乳性能。結果提示，lncRNA MSTRG.17186、lncRNA MSTRG.5366、CITED4和ROBO1可能是熱應激母豬泌乳過程的重要調控因子。需要進一步研究lncRNA與HS下泌乳調控的分子機制。
本研究的RNA測序和分析由上海派森諾生物科技有限公司完成
參考文獻：Ni Y, Wu F, Chen Q, Cai J, Hu J, Shen J, Zhang J. Long noncoding RNA and mRNA profiling of hypothalamic-pituitary-mammary gland axis in lactating sows under heat stress. Genomics. 2020 Sep;112(5):3668-3676. doi: 10.1016/j.ygeno.2020.04.021.
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