2021-09-02
發(fā)表雜志：Journal of Hepatology
影響因子：25.083
發(fā)表時間：2021年6月9日
高通量測序方法：單細(xì)胞測序，外顯子測序，轉(zhuǎn)錄組測序
樣本設(shè)置：11例腺癌和2例腺鱗癌原發(fā)病例的癌和癌旁組織分別進(jìn)行單細(xì)胞測序；41例腺癌和11例腺鱗癌病例進(jìn)行免疫組化和免疫熒光驗證。通過外顯子測序?qū)颖痉譃镋rbB通路突變組（case組）和ErbB通路不突變組（control組）。
研究思路
1、腫瘤異質(zhì)性研究
對13例原發(fā)病例的癌組織和癌旁組織的26個樣本進(jìn)行單細(xì)胞測序，共獲得114927個細(xì)胞。鑒定到16種細(xì)胞類型，分別是上皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞_VEF，內(nèi)皮細(xì)胞_DCN，肌成纖維細(xì)胞，CAF_MFAP5，CAF_ACTA2，肥大細(xì)胞，濾泡B細(xì)胞，漿細(xì)胞，Treg，CD4 T細(xì)胞，CD8 T細(xì)胞，單核細(xì)胞，M1巨噬細(xì)胞，M2巨噬細(xì)胞和DC細(xì)胞。對單細(xì)胞測序結(jié)果和Bulk RNA測序結(jié)果進(jìn)行對照分析顯示兩者異質(zhì)性高，說明單細(xì)胞測序結(jié)果是具有代表性的。不同細(xì)胞類型的數(shù)目在癌和癌旁具有較大差異，在腫瘤區(qū)域，M2巨噬細(xì)胞，Treg和上皮細(xì)胞的數(shù)目更多，而在癌旁區(qū)域，CAF_MFAP5，內(nèi)皮細(xì)胞_DCN和單核細(xì)胞的數(shù)目更多，說明膽囊癌病人中腫瘤內(nèi)和腫瘤間均具有較大的一致性。
2、上皮細(xì)胞亞群分析
絕大多數(shù)膽囊癌都是起源于上皮細(xì)胞，因此對上皮細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步分析。上皮細(xì)胞可分為四個亞群，其中亞群1，2，3是腺癌病人特有的，亞群4是腺鱗癌病人特有的。不同亞群的高表達(dá)基因和信號通路不盡相同。利用拷貝數(shù)變異分析對上皮細(xì)胞進(jìn)行分析結(jié)果顯示，癌組織具有更高的拷貝數(shù)變異。
對四個亞群的上皮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞演化分析結(jié)果顯示，亞群1在癌旁至癌區(qū)域呈現(xiàn)逐漸降低；亞群2則呈現(xiàn)相反趨勢。利用擬時序分析針對正常態(tài)，中間態(tài)，腫瘤態(tài)的細(xì)胞鑒定其惡變前狀態(tài)，鑒定到type1和type2的中間態(tài)臨界點。臨界點相對于亞群1高表達(dá)了腫瘤促進(jìn)基因，如MYC，CXCL5等，亞群2相對易臨界點2高表達(dá)了 ENO1，CDK1等基因。通過該分析找到了腫瘤發(fā)生和進(jìn)化的功能基因。
3、膽囊癌病例的外顯子測序分析
與此同時，對上述病例進(jìn)行了外顯子測序分析，發(fā)現(xiàn)3個病例的ErbB通路發(fā)生體細(xì)胞突變，因此，將病例分成ErbB通路突變組（Case組）和ErbB通路無突變組（control組）。
4、ErbB通路突變組和ErbB通路無突變組的差異分析
對兩組病例的細(xì)胞數(shù)目比較發(fā)現(xiàn)，case組的Treg和M2細(xì)胞等免疫抑制細(xì)胞數(shù)目增多，并通過另外一個隊列的21例case組和20例control組的免疫組化結(jié)果進(jìn)行驗證，獲得了一致的結(jié)果。Case組表達(dá)更高Treg marker基因FOXP3和M2巨噬細(xì)胞的marker基因CD163，與單細(xì)胞測序的細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計結(jié)果一致。
針對case組和control組的細(xì)胞通訊分析結(jié)果顯示，上皮細(xì)胞亞群1和亞群2在case 組與Treg，單核細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞的細(xì)胞通訊更強(qiáng)。上皮細(xì)胞亞群2是在腫瘤區(qū)域高度富集的細(xì)胞，對這些細(xì)胞的分泌蛋白分析顯示，CD24，MDK和SERPINA1等在case組的表達(dá)更高，這一結(jié)果也經(jīng)過bulk RNA測序進(jìn)行驗證。通過細(xì)胞通訊分析顯示case組的巨噬細(xì)胞通過MDK-LRP1，MDK-SORL1的受體-配體關(guān)系與上皮細(xì)胞具有強(qiáng)的細(xì)胞通訊。
5、MDK-LRP1促進(jìn)免疫抑制巨噬細(xì)胞分化
MDK在腫瘤微環(huán)境中有不同的細(xì)胞間通訊，鑒于case組具有更多的免疫抑制巨噬細(xì)胞，我們推測MDK可能參與了免疫逃逸反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)case組的STAT及其下游基因CXCL9和CXCL10在免疫抑制巨噬細(xì)胞中的表達(dá)以及通過CXCL10-CXCR3與CD4+ T細(xì)胞和Treg細(xì)胞的通訊高于control組，說明case組的上皮細(xì)胞對免疫細(xì)胞的免疫逃逸，可能依賴于M2巨噬細(xì)胞招募或激活CD4+ T細(xì)胞和Treg細(xì)胞。
為進(jìn)一步驗證MDK對M2巨噬細(xì)胞分化的作用，用MDK重組蛋白以及膽囊癌腫瘤細(xì)胞的條件培養(yǎng)基處理巨噬細(xì)胞細(xì)胞系THP-1，通過細(xì)胞形態(tài)觀察、M2 marker基因的WB，以及流式驗證M2巨噬細(xì)胞增加。在case組的M1和M2巨噬細(xì)胞中高表達(dá)MDK的受體LRP1。用LRP1的中和抗體處理PBMC細(xì)胞，或在THP1細(xì)胞系敲低LRP1，MDK均無法促進(jìn)THP1的分化。以上結(jié)果說明MDK-LRP1參與免疫抑制細(xì)胞的分化。
為進(jìn)一步驗證MDK激活的M2巨噬細(xì)胞是否招募Treg細(xì)胞，用transwell實驗（上層培養(yǎng)PBMC細(xì)胞，下層培養(yǎng)MDK處理的THP1細(xì)胞）進(jìn)行驗證。共培養(yǎng)后的下層細(xì)胞可以用流式檢測到Treg細(xì)胞，說明MDK誘導(dǎo)的M2巨噬細(xì)胞可以招募Treg細(xì)胞。
最后，對MDK的預(yù)后分析結(jié)果顯示，MDK在case組的表達(dá)高，并且MDK的高表達(dá)與更低的整體生存率顯著相關(guān)。免疫熒光實驗顯示case組高表達(dá)MDK，CD163和FOXP3，進(jìn)一步驗證在case組中，MDK促進(jìn)免疫抑制細(xì)胞的浸潤以及招募Treg細(xì)胞。以上結(jié)果均說明ErbB信號通路突變上調(diào)MDK，促進(jìn)免疫抑制巨噬細(xì)胞的分化而招募Treg細(xì)胞到腫瘤微環(huán)境，導(dǎo)致免疫逃逸和腫瘤進(jìn)展。
總結(jié)
本文利用單細(xì)胞測序獲得了膽囊癌的腫瘤微環(huán)境圖譜，利用外顯子測序結(jié)果設(shè)置case組和control組，獲得了單細(xì)胞測序結(jié)果比較分析的策略。比較分析涵蓋細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計、基因表達(dá)、信號通路、擬時序和細(xì)胞通訊等所有的單細(xì)胞測序分析結(jié)果。此外，對單細(xì)胞測序結(jié)果進(jìn)行RNAseq、免疫組化和免疫熒光的驗證，獲得了更強(qiáng)的數(shù)據(jù)支持。通過單細(xì)胞測序聚焦到MDK-LRP1這對受體和配體，通過這對基因在case和control表達(dá)情況差異以及兩者對應(yīng)的細(xì)胞數(shù)目、基因表達(dá)等的差異，推測MDK-LRP1參與免疫抑制M2巨噬細(xì)胞的分化及對Treg的招募和激活。通過組學(xué)分析獲得的結(jié)論，通過傳統(tǒng)分子生物學(xué)實驗進(jìn)行驗證，獲得了更強(qiáng)有力的數(shù)據(jù)支持。
這種大規(guī)模 GBC 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)構(gòu)建了一個寶貴的資源，揭示了個體腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞的遺傳特性發(fā)生變化，這些細(xì)胞和免疫細(xì)胞協(xié)同驅(qū)動腫瘤惡性轉(zhuǎn)化。
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