2021-08-17
期刊：Science of the Total Environment
影響因子：7.963
近期，派森諾與南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院合作，在Science of the Total Environment上發(fā)表了題為《USP15 participates in DBP-induced testicular oxidative stress injury through regulating the Keap1/Nrf2 signaling pathway》的研究成果。該研究表明，USP15通過調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2信號通路，對DBP引起的睪丸氧化應(yīng)激損傷起到保護(hù)作用。
1、研究背景
鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)是一種廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的鄰苯二甲酸酯，尤其是塑料工業(yè)。DBP由于其內(nèi)分泌毒性危害大，在世界范圍內(nèi)受到越來越多的關(guān)注。流行病學(xué)證據(jù)表明，長期暴露于DBP可對人體各器官，特別是男性生殖系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p害。動物實驗表明，DBP可滅活雄性大鼠睪酮合成的關(guān)鍵酶，導(dǎo)致生精細(xì)胞凋亡和睪丸萎縮。此外，宮內(nèi)暴露DBP可破壞后代大鼠尿道和生殖結(jié)節(jié)的分化發(fā)育，導(dǎo)致尿道下裂、隱睪等一系列先天性畸形。DBP可誘導(dǎo)體外和體內(nèi)支持細(xì)胞和Leydig細(xì)胞凋亡和炎癥。既往研究表明，氧化應(yīng)激損傷在DBP誘導(dǎo)的生殖毒性中起重要作用，Nrf2抗氧化途徑可能是機(jī)體應(yīng)對此類外源性損傷的保護(hù)機(jī)制。去泛素化酶(DUBs)參與多種細(xì)胞過程，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)降解、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和DNA修復(fù)。
USP15是UBP/USP家族的去泛素酶。USP15可以通過去泛素化Keap1穩(wěn)定Cul3-Keap1-E3連接酶復(fù)合物，導(dǎo)致E3連接酶活性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致Nrf2降解。然而，USP15對Nrf2途徑介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制尚未明確。本研究旨在闡明USP15在DBP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷中的作用，并尋找USP15可能的上游調(diào)控因子。
2、研究思路
3、研究內(nèi)容
1. DBP處理后Nrf2通路的激活
DBP處理后Nrf2及其下游抗氧化劑(NQO1、HO-1和GCLC) mRNA水平顯著上調(diào)，Cul3表達(dá)升高，而Keap1則無明顯變化。隨后，我們通過WB檢測Nrf2通路的蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示,Nrf2的蛋白質(zhì)含量明顯升高,而Cul3的蛋白表達(dá)和Keap1持平。此外,免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)一步驗證Nrf2通路的激活。
為了探討DBP處理后泛素化Nrf2 (Ub-Nrf2)和泛素化Keap1 (Ub-Keap1)的變化，我們做了抗Nrf2、抗Keap1的CO-IP實驗。結(jié)果顯示DBP組中Ub-Nrf2水平降低，Ub-Keap1水平升高。
2. RNASeq揭示DBP處理關(guān)鍵基因變化
我們對DBP處理組和對照組的3對睪丸樣本進(jìn)行RNA測序并分析。差異分析結(jié)果共發(fā)現(xiàn)4957個上調(diào)基因和6016個下調(diào)基因。剔除不滿足條件的基因后，篩選出25個差異表達(dá)的DUBs。隨后，我們進(jìn)行RT-qPCR和western blot進(jìn)一步驗證差異表達(dá)。最終發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DBP處理后，Cyld、USP1、USP15和Tnfaip3等4個DUB的mRNA和蛋白水平均發(fā)生變化。
3. USP15參與Nrf2激活和Nrf2/Keap1泛素化
我們通過過表達(dá)Tnfaip3和沉默Cyld、USP1和USP15的表達(dá)，模擬DBP處理后四種酶的變化趨勢。結(jié)果顯示，Cyld和USP15敲低后Nrf2、NQO1、HO-1和GCLC蛋白表達(dá)上調(diào)，而USP1敲低或Tnfaip3過表達(dá)后無明顯變化。此外，我們還研究了Cyld和USP15敲除后Nrf2和Keap1的泛素化水平是否發(fā)生變化。結(jié)果顯示，USP15敲低后，小鼠體內(nèi)Ub-NRf2水平降低，Ub-Keap1水平升高。
為了進(jìn)一步驗證USP15對Nrf2或Keap1去泛素化的調(diào)控機(jī)制，我們分別在HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了Myc-USP15及其突變體Myc-USP15-C783A。研究結(jié)果顯示，USP15能夠去泛素化Keap1，但不能去泛素化Nrf2。
4. DBP誘導(dǎo)GC-1和GC-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷
不同濃度(0、10、50、100 mg/l) DBP處理GC-1和GC-2細(xì)胞24 h，檢測細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)。ROS分析結(jié)果顯示，隨著DBP濃度的增加，細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷越嚴(yán)重。
5. USP15的降低增強(qiáng)了DBP處理后Nrf2通路的激活
我們通過慢病毒轉(zhuǎn)染，將USP15在GC-1和GC-2細(xì)胞中敲除和過表達(dá)來研究USP15對Nrf2通路的影響，結(jié)果表明，在DBP處理后，USP15的下調(diào)可顯著增強(qiáng)Nrf2通路的激活，而USP15的升高則抑制Nrf2通路的激活。
DHE染色顯示過表達(dá)USP15時，ROS熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，沉默USP15時，ROS熒光強(qiáng)度減弱。故在生殖細(xì)胞中低水平的USP15表達(dá)可減輕DBP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，而高水平的USP15表達(dá)可加重機(jī)體的氧化應(yīng)激損傷。
6. MiR-135b-5p是USP15的上游調(diào)控因子，可減弱DBP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷
為了探索USP15的上游調(diào)控因子，我們做了miRNA轉(zhuǎn)錄組測序，包括差異分析和靶基因分析等，最終篩選出miR-135b-5p作為USP15的潛在調(diào)控因子。基于USP15的3'-UTR中潛在的結(jié)合區(qū)域，我們設(shè)計了熒光素酶報告質(zhì)粒，其中包含USP15的3'-UTR中預(yù)測的結(jié)合位點(USP15-wt)或突變的USP15來觀察熒光變化。結(jié)果表明USP15是miR-135b-5p的直接功能靶基因，且miR-135b-5p可減輕USP15負(fù)調(diào)控下DBP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。
4、文章小結(jié)
綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)Keap1/Nrf2抗氧化途徑可能參與了DBP誘導(dǎo)的睪丸氧化應(yīng)激損傷、睪丸發(fā)育不良和精子發(fā)生障礙。同時，我們發(fā)現(xiàn)DBP處理后Keap1/Nrf2的泛素化途徑發(fā)生變化。此外，我們還驗證了USP15表達(dá)的減少可以抑制Nrf2的泛素化降解，緩解DBP誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。證實了miR-135b-5p可通過負(fù)調(diào)控USP15減弱DBP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。因此，我們推測USP15抑制介導(dǎo)的Keap1/Nrf2泛素化途徑的改變可能是機(jī)體對DBP引起的睪丸氧化還原狀態(tài)失衡的自我保護(hù)機(jī)制。
本研究的miRNA和mRNA測序及分析由上海派森諾生物科技有限公司完成。
