2021-08-17
期刊：Cell&Bioscience
影響因子：7.133
2021年5月派森諾攜手華西口腔醫院周學東老師團隊在Cell&Bioscience （IF=7.133）期刊發表研究成果。本文通過X射線篩選了一株變異鏈球菌突變體#858，通過細菌重測的方法研究了主要致齲菌變異鏈球菌的基因組突變和致齲性變化，為輻射可以直接影響變異鏈球菌的表型和誘導毒力基因突變提供了有價值的信息，并提示接受放射治療的患者除了要注意輻射引起的組織損傷外，還應警惕口腔病原菌的毒力變化。
研究思路
研究背景
放射治療（RT）在頭頸癌（HNC）的治療中起著至關重要的作用，但是其可能會對頭頸部周圍組織產生不利影響，導致一系列副作用，如淋巴功能減退、放射性齲齒（RC）和粘膜炎。RC是放射治療后的典型臨床癥狀，可導致牙齒侵襲性破壞，咀嚼效能喪失、持續性慢性口輕感染和放射性骨壞死。放射治療后口腔微生物的變化被認為是放射性齲病發生的病因之一。有研究發現致齲微生物種類包括變異鏈球菌屬、乳桿菌屬和念珠菌屬等。以往的研究主要集中在放射治療后口腔菌群的種類組成和豐度變化上，對口腔菌群的功能性質研究較少。其中變異鏈球菌在頭頸部照射后牙菌斑的豐度顯著增加，表明其在放射性齲病中起主要作用。然而，輻射對變異鏈球菌基因組和毒力的影響仍未被研究過。在本研究中，通過對變異鏈球菌進行X射線照射，然后分析其基因組的變化及其致齲性，以探討X射線是如何直接影響口腔細菌的。
研究材料和方法
實驗材料：變異鏈球菌野生型UA159X射線輻照后得到的變異鏈球菌突變體#858
測序平臺：Illumina Hiseq
分析內容：qRT?PCR、生物膜成像、細菌重測序、構建點突變菌株與敲除菌株、蛋白分離和SDS-PAGE、大鼠齲病模型實驗等。
研究結果
1. X射線輻照對變異鏈球菌生物膜形成能力的影響
測試了變異鏈球菌對X射線的敏感性，發現其存活率隨著X射線劑量的增加而降低（圖1a）。在X射線對變異鏈球菌輻照后，變異鏈球菌懸浮液的生物膜形成能力明顯高于對照組（p?<?0.05），但各實驗組之間沒有顯著差異（圖1b）。為了探討變異鏈球菌細胞的個體表型變化，從輻照樣品中隨機分離了147個變異鏈球菌單菌落，在這些菌株中觀察到不同的生物膜形成能力（圖1c），其中菌株#858的生物膜形成能力降低最為明顯。這些結果表明，治療劑量的X射線可以影響變異鏈球菌的毒力特性。
圖1. X射線對變異鏈球菌細胞活力和生物膜形成能力的影響
2.菌株#858胞外多糖產量及生物膜結構變化
分離得到的147株菌種中，80Gy組分離得到了生物膜形成缺陷較多的菌株#858，其生物膜形成能力顯著低于野生型菌株（WT），且其生物膜在結晶紫染色過程中極易脫落（圖2a,b），這表明菌株#858缺乏正常的粘附能力和生物膜形成能力。#858和WT之間的生長率沒有顯示出顯著差異（圖2c），表明#858的生物膜形成缺陷與細胞生長能力無關。SEM分析和共聚焦激光掃描顯示，與WT相比，#858的生物膜不僅稀疏得多，且幾乎沒有EPS（胞外多糖）分布（圖2d,e,f,g）。進一步測量了EPS相關基因的表達，發現菌株#858的EPS生物合成基因（gtfB、gtfC、gtfD）均顯著下調（圖2h）。
圖2.菌株#858生物膜形成能力降低
3. X射線引起gtfB基因同義突變
為了研究#858的生物膜形成缺陷是否由X射線引起的基因組突變引起，對#858進行了重測序分析。結果顯示與WT相比，#858在gtfB上有3個同義突變位點（表1），包括c.2043T>C、 c.2100C>T、c.2109A>G，分別編碼異亮氨酸、精氨酸和精氨酸。基于密碼子使用數據庫中變異鏈球菌UA159的密碼子使用頻率，發現突變的密碼子c.2043T>C在轉錄水平上從AUU變為AUC，其使用頻率從53.4‰下降到15.9，而另兩個突變位點則前后無明顯差異，這可能是#858生物膜形成能力喪失的原因。
表1. 菌株#858相比野生型UA159所具有的基因突變
4.同義點突變菌株gtfB 2043T>C降低了EPS的產生和生物膜的形成
通過同源重組構建了一株點突變菌株 gtfB 2043T>C ，同時構建了gtfB敲除菌株ΔgtfB 作為對照。圖3可以看出，與菌株#858相同，突變菌株gtfB 2043T>C和ΔgtfB菌表現出生物膜形成相較WT減少且不完整（ΔgtfB生物膜幾乎完全脫落），這三株菌幾乎不具有細胞外基質，同時生物膜厚度和EPS顯著降低。尤其重要的是，與WT相比，這三種菌株中gtfB的表達顯著下調。為了研究gtf基因轉錄的變化是否會影響酶的產生，對Gtfs蛋白進行研究。結果表明，所有組的GtfB/D均從GtfC中分離出來，其中，與WT相比，#858、 gtfB 2043T>C和ΔgtfB的GtfB/D帶顯著降低。Gtf酶的蛋白表達表明，gtfB的“沉默突變”不僅降低了gtf基因的轉錄水平，而且降低了Gtf基因的蛋白水平。
圖3. 點突變菌株gtfB 2043T>C可以降低EPS的產生及生物膜的形成
5. 同義突變體C.2043T>C體外抑制牙齒脫礦
為了驗證同義突變c.2043T>C引起的GTFB降低是否會影響脫礦能力，分別使用使用橫向顯微照相（TMR）測試變異鏈球菌菌株的脫礦效果。處理72h后，所有變異鏈球菌均引起明顯的釉質脫礦。其中三個菌株#858、 gtfB 2043T>C和ΔgtfB的礦物質損失和病變深度顯著低于WT，而他們三者間無較大顯著差異（圖4）。
圖4.點突變菌株gtfB2043T>C可以抑制牙釉質脫礦
6.同義突變c.2043T>C體內致齲性降低
比較了變異鏈球菌菌株在體內的致齲能力，發現感染小鼠的變異鏈球菌中，WT定植水平顯著高于其他三組，表明gtfB基因突變可抑制口腔環境中變異鏈球菌的定植。與WT相比，感染#858、 gtfB 2043T>C和ΔgtfB的小鼠齲病發生率和嚴重程度顯著降低（圖5，表2）。
綜上所述，gtfB基因的同義突變c.2043T?>C在體外可減少牙齒脫礦，在體內可降低變異鏈球菌的致齲能力。
圖5. gtfB基因的同義突變可降低變異鏈球菌的致齲能力
表2.鼠齲齒評分（Keyes評分）
研究結論
本文首次研究了主要致齲菌變異鏈球菌在X射線的治療劑量照射下其基因組突變和毒力變化。研究發現治療劑量的輻射可以直接影響變異鏈球菌的表型并且分離到了一株生物膜形成缺陷突變體#858，該突變體在體外和體內均表現出胞外多糖生成能力、生物膜形成能力和致齲能力的降低。重測序結果表明，#858只有三個同義突變，gtfb基因的C.2043T>C的“沉默突變”可導致所有gtfs基因的表達下調，減少gtfb酶的分泌，而不會因密碼子偏向而影響生長。由于密碼子使用頻率的不同，基因組的同義突變對基因表達和相關蛋白的翻譯都是可以忽略的因素。該研究為輻射可以直接影響變異鏈球菌的表型和誘導毒力基因突變提供了有價值的信息，并提示接受放射治療的患者除了要注意輻射引起的組織損傷外，還應警惕口腔病原菌的毒力變化。
本研究的細菌重測序和部分數據分析工作由上海派森諾生物科技有限公司完成。
文章索引：Wang Z, Zhou Y, Han Q, et al. Synonymous point mutation of gtfB gene caused by therapeutic X-rays exposure reduced the biofilm formation and cariogenic abilities of Streptococcus mutans. Cell Biosci. 2021;11(1):91. Published 2021 May 17. doi:10.1186/s13578-021-00608-2
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