2021-08-03
期刊：《Journal of Hazardous Materials》
影響因子：10.588
細菌基因組denovo測序相關的多組學聯合分析再添高分文章啦！派森諾生物與東北農業大學資源與環境學院李春艷老師攜手，再次在微生物基因組領域的《Journal of Hazardous Materials》（IF=10.588）發表研究成果！文章通過細菌完成圖+轉錄組+代謝組+實驗驗證，報道了莫氏芽孢桿菌XH1分泌的一種新的生物破乳草酸脫羧酶（OxdC），為OxdC作為一種新的遺傳資源在生物破乳中的應用提供了新的視角。
研究背景
生物破乳具有低毒、可生物降解性、環境友好型和天然產物的特殊性質等優點，其在石化、食品、醫藥等領域具有著廣泛的應用。目前常用的生物破乳劑主要是細胞壁或疏水表面的小分子，這些小分析生物破乳劑通常對W/O（油包水）乳狀液有良好的破乳效果，但對O/W(水包油)乳狀液的破乳效果不好。此外，細胞壁上的生物破乳劑還收到細胞生長和代謝的影響，一旦細胞死亡，這些分析就會失去破乳能力。一般老說，生物大分子破乳劑比小分子生物破乳劑表現出更好的增稠性、穩定性和絮凝性。分子生物破乳劑的粘度越高，其吸附性能越好，油水界面上的吸附可以促進破乳。本研究的莫氏芽孢桿菌XH1能夠分泌一種大分子生物破乳劑，但到目前為止，大分子生物破乳劑的研究還很少。
研究材料和方法
1.實驗設計
2.實驗材料：油田土壤中篩選得到的具有較高破乳效率的莫氏芽孢桿菌XH1一株
3.測序平臺：Illumina Miseq+Pacbio
4.分析內容：細菌完成圖測序、轉錄組測序、代謝組測序、基因敲除與互補實驗、基因表達與蛋白質純化實驗、酶活實驗等。
研究結果
為研究菌株XH1的生長和破乳效果，分別以葡萄糖和液體石蠟為唯一碳源，結果發現以葡萄糖為唯一碳源時，菌株生長良好，但是發酵液幾乎沒有破乳能力；以液體石蠟為唯一碳源時，破乳率達94%，說明碳源的不同會影響菌株XH1生物破乳劑的合成，遂對該菌株的生物破乳劑合成過程中的差異進行了研究。
對菌株XH1進行基因組測序得到一條 4,203,618 bp的染色體，GC含量43.65%，基因預測總共得到4503個基因，在COG、GO、KEGG和Swissport數據庫中分別注釋到3060, 2617, 2306和3996個基因。注釋結果發現：基因組中有和烴類降解相關的基因，另外因為該菌株長期存在與烴類環境中，其降解烴類化合物的能力被馴化，這一研究表明細菌降解烴類化合物除了和基因有關，還可馴化有關；除蛋白質生物破乳劑外，還發現了脂肽輔助的破乳劑成分。對已知的具有破乳活性的菌株做比對發現，不同菌株產生的生物破乳劑的活性和種類均不盡相同，并且發現了對生物破乳劑的產生器決定性作用的---疏水烷烴的存在。
對菌株XH1進行轉錄組測序發現，OxdC基因表達差異最明顯，最有可能是生物破乳相關的蛋白質，其他幾種蛋白質也參與了這個過程，如孢子相關蛋白和細胞內蛋白。據報道，OxdC可以在沒有信號肽的情況下分泌到細胞外，并與烷烴代謝密切相關。為了進一步驗證此結果，用硫酸銨對菌株XH1分泌的胞外蛋白進行了純化，結果發現隨著硫酸銨的濃度增加胞外蛋白的破乳率也隨之增加，在鹽濃度為75%的時候獲得目的蛋白，代謝組研究結構初步預測現有的蛋白OxdC是活性破乳蛋白之一。該蛋白由376AA組成，42,653bp，等電位點為5.16。結合轉錄組分析，進一步證實OxdC為破乳靶蛋白。轉化實驗和OxdC的敲除與互補實驗，則進一步表明了OxdC參與了菌株XH1的烷烴代謝，OxdC是一種具有新功能的破乳蛋白。
為了進一步研究OxdC的結構和功能，做了如下研究：使用熱重分析（TGA）評估該蛋白具有良好的熱穩定性；ProtScale分析蛋白的親水性和疏水性發現OxdC的表明疏水性相對較強；使用PyMOL對OxdC的三級結構進行預測，發現Mn2+不僅通過與鄰近氨基酸的相互作用而穩定，而且通過與兩個水分子形成氫鍵而保持穩定，這可能屆時了OxdC具有破乳功能的原因。
因為菌株XH1在不同碳源下的破乳劑產生情況不一致，故分別對以葡萄糖和液體石蠟為唯一碳源時的代謝途徑進行了比較。當以液體石蠟為唯一碳源時，烷烴通過氧化轉化為醇、醛和酸，氧化脂肪酸進入脂肪酸循環，經β氧化生成乙酰輔酶A；乙酰輔酶A進入三氯乙酸循環，生成草酰乙酸酯；草酰乙酸酯經過乙醛酸和二元酸代謝，生成乙醛酸。草酰乙酸還可以通過乙醛酸氧化酶的活性直接水解生成OA，在酸性條件下生成OA脫羧酶(OxdC)，將OA降解為水和CO2。菌株XH1以葡萄糖為底物時pH相對穩定，不產生OA或誘導OxdC產生，在這種情況下沒有破乳，而當使用液體石蠟作為底物時，可以觀察到有效的破乳。
研究結論
本研究報道了莫氏芽孢桿菌XH1分泌的一種新的生物破乳草酸脫羧酶(OxdC)，全基因組比較表明，具有較高破乳效率的菌株均具有烷烴降解基因。對不同底物誘導的差異表達基因和蛋白的分析表明，XH1分泌的OxdC是一種有效的破乳劑。并通過原核基因表達、基因敲除和互補分析驗證了其破乳能力。XH1的OxdC具有較強的破乳能力，其破乳能力明顯優于模式蛋白枯草芽孢桿菌168OxdC(Yvrk)。通過對其結構特征的比較，確定OxdC表面的疏水氨基酸是XH1良好破乳活性的關鍵因素。XH1的代謝途徑以液體石蠟和葡萄糖為底物，說明碳氫化合物是生物破乳劑分泌所必需的。這一研究結果為XH1資源的開發利用提供了重要參考，不僅對石油污染治理有一定的參考價值，而且對食品、醫藥等行業也有一定的參考價值。因此，具有廣泛的生態、社會效益和經濟效益和應用前景。
本研究的細菌完成圖測序和數據分析工作由上海派森諾生物科技有限公司完成。
文章索引：Hou, Ning & Wang, Qiaoruo & Sun, Yang & Li, Xianyue & Song, Qiuying & Jiang, Xinxin & Li, Baoxin & Zhao, Xinyue & Zang, Hailian & Li, Dapeng & Li, Chunyan. (2021). A novel biodemulsifier of Bacillus mojavensis XH1–Oxalate decarboxylase with the potential for demulsification of oilfield emulsion. Journal of Hazardous Materials. 407. 124737. 10.1016/j.jhazmat.2020.124737.
