2021-06-15
期刊：Genomics
影響因子：6.2
文章題目：De novo assembly transcriptome analysis reveals the preliminary molecular mechanism of pigmentation in juveniles of the hard clam Mercenaria mercenaria
發表期刊：Genomics
技術手段：RNA-Seq+qPCR
派森諾生物與中國科學院海洋研究所攜手合作，于近期在《Genomics》上發表了無參轉錄組分析揭示幼體硬殼蛤（Mercenaria mercenaria）色素沉著的初步分子機制相關研究成果。
/ 研究背景/
顏色是個體重要的表型特征，并且與偽裝、免疫、體溫調節等生物學功能相關。軟體動物具有豐富的外殼顏色，但是，人們對貝殼色素沉著的了解仍然很有限。已有學者利用雜交進行的遺傳分析表明，貝殼的顏色可以由基因調控。研究表明，鈣信號轉導、黑色素合成、卟啉和葉綠素代謝等相關基因參與生物外殼的色素沉著與調控。這些研究大多數以雙殼類動物的外被膜作為研究材料，但是，雙殼類動物幼體時期是開始色素沉著的重要時期卻往往被忽視。
硬殼蛤（Mercenaria mercenaria）是一種有著重要商業價值的雙殼類動物，其養殖品種具有豐富的殼色變異。本研究根據色素沉著情況將幼體硬殼蛤分為三組，采用RNA-Seq技術進行分析，從中鑒定出參與色素沉著的候選基因和相關代謝通路。
/ 研究方法 /
樣本：無色素沉著幼體硬殼蛤（NP）、白色幼體硬殼蛤（W）、紅色幼體硬殼蛤（OP）
實驗方法：轉錄組測序
測序平臺：Illumina NovaSeq
技術路線圖見下：
/ 研究結果 /
1.轉錄組測序結果，注釋以及差異表達基因（DEGs）分析
借助二代轉錄組測序技術，對NP、W、OP三組幼體硬殼蛤，每組三個重復，一共9個樣品進行轉錄組測序。通過轉錄本拼接共得到149234個unigenes，N50為1567 bp，對unigene功能注釋鑒定出很多與信號轉導相關的基因。
為了評估在不同分組的基因表達量變化，對三組幼體硬殼蛤的轉錄表達情況進行兩兩比較。在OP vs NP比較組中檢測到2133個上調基因，1708個下調基因。W vs NP比較組中有1824個上調基因和1628個下調基因。OP vs W比較組中發現179個上調基因和71個下調基因。
為了更好地了解DEGs的功能，作者進行了KEGG富集分析。結果顯示，OP vs NP比較組富集了282條途徑，其中有51條途徑顯示顯著富集（表1），富集最顯著的前20個代謝通路如圖1A所示。W vs NP和OP vs W比較組分別富集了266和122條途徑，且分別有45和15條途徑顯示顯著富集（表2，表3），富集最顯著的前20個代謝通路如圖1B和圖1C所示。DEGs主要在黑色素瘤、卟啉和葉綠素代謝以及ABC轉運通路中富集。
表1 OP vs NP顯著富集途徑條目
圖1A OP vs NP KEGG 富集分析
表2 W vs NP顯著富集途徑條目
圖1B W vs NP KEGG 富集分析
表3 OP vs W顯著富集途徑條目
圖1C OP vs W KEGG 富集分析
2.與色素沉著相關的候選基因鑒定
作者研究發現，紅色硬殼蛤的黑色素和胡蘿卜素濃度明顯高于白色硬殼蛤。色素前體分子可以通過ABC轉運蛋白運輸到色素細胞，并且四吡咯是軟體動物中另一種主要的色素。因此，作者挑選了黑色素瘤/黑色素生成、類胡蘿卜素相關代謝通路、ABC轉運體以及卟啉和葉綠素代謝的DEGs進行聚類熱圖分析。聚類結果如下：
A.在黑色素瘤/黑色素生成代謝通路途徑中，W組首先與OP組聚集，然后與NP組聚集。在該通路中發現了小眼畸形相關轉錄因子（MITF）、酪氨酸酶（TYR）和鈣離子結合相關基因。TYR是合成黑色素所必需的，MITF對TYR具有調控作用。TYR在OP和W組中高表達，MITF在W組中表達相對下調（圖2a）。
B.在ABC轉運體代謝通路中，W組先與OP組聚類，然后與NP組聚類。ABC轉運體可能通過轉運色素前體來介導色素沉著。相比于W和NP組，ABCA、ABCC和ABCG在OP組中高表達（圖2b）。
C.類胡蘿卜的攝取、運輸和分解在類胡蘿卜色素沉著中起著至關重要的作用。在類胡蘿卜素相關代謝通路中清道夫受體、低密度脂蛋白受體相關蛋白和載脂蛋白等的Unigenes差異表達（圖2c）。
D.與W組相比，OP組中卟啉和葉綠素代謝顯著富集，表明該途徑在硬殼蛤中紅色素的形成中發揮了作用（圖2d）。
圖2 顯示關注的KEGG通路中基因表達水平的聚類熱圖: A) 黑色素瘤/黑色素生成; B) ABC轉運體; C) 類胡蘿卜素相關代謝通路; D)卟啉和葉綠素代謝。
3.關鍵基因qRT-PCR驗證
為了驗證RNA-Seq數據的可靠性，作者從DEGs中選取10個 unigenes，使用qRT-PCR進行驗證。如圖3所示，轉錄組數據與qRT-PCR結果一致，在OP組中ABCA1, ABCA3, ABCC1和 ABCG5-like的表達量最高。
圖3 10個基因的qRT-PCR驗證
/ 總結 /
色素是貝殼顏色產生的主要原因。在本研究中，作者對非色素沉著、白色和紅色的硬殼蛤進行了RNA-Seq分析，以探討幼體硬殼蛤色素沉著的機制。DEGs有黑色素瘤/黑色素形成、ABC轉運體、類胡蘿卜素代謝相關途徑、卟啉和葉綠素代謝，可能參與色素的形成和調控。這些發現表明黑色素和類胡蘿卜素可能是硬蛤殼的主要色素。值得注意的是，與脂質轉運、ABC轉運蛋白、卟啉和葉綠素代謝相關的基因，可能是這些硬殼蛤殼呈紅色的原因。
本研究的測序和數據分析工作由上海派森諾生物科技有限公司完成。
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