2021-04-21
發(fā)表期刊：Advanced Functional Materials
影響因子：16.834
文章題目：Aligned PCL Fiber Conduits Immobilized with Nerve Growth Factor Gradients Enhance and Direct Sciatic Nerve Regeneration
技術(shù)手段：轉(zhuǎn)錄組測序
派森諾生物與西安交通大學附屬紅會醫(yī)院攜手合作，于近期在材料科學領(lǐng)域期刊《Advanced Functional Materials》上發(fā)表了功能性神經(jīng)修復材料制備及神經(jīng)軸突趨化生長機制方面的研究進展。
研究背景
周圍神經(jīng)損傷是常見的骨科疾病，其可導致受損神經(jīng)區(qū)域的感覺和運動功能喪失，甚至終身殘疾。長期以來，自體神經(jīng)移植被認為是臨床修復長度超過10mm的周圍神經(jīng)缺損的方案。然而，供體神經(jīng)來源有限以及供-受體神經(jīng)匹配較差均限制了這一技術(shù)在臨床中的應(yīng)用。
隨著工程技術(shù)和新生物材料技術(shù)的發(fā)展，制備功能仿生的神經(jīng)導管已成為周圍神經(jīng)缺損的合適手段。在這一技術(shù)中，材料的形貌引導和趨化作用是周圍神經(jīng)再生的關(guān)鍵因素，即：使用具有對齊結(jié)構(gòu)、有序化排列的纖維導管更有利于引導神經(jīng)再生，且以往體外研究證實，神經(jīng)軸突更傾向于神經(jīng)生長因子濃度高的一側(cè)延伸，因此結(jié)合了有序化排列結(jié)構(gòu)和生長因子梯度分布的導管將在神經(jīng)修復中達到令人滿意的效果。但按傳統(tǒng)方式制備出的纖維導管內(nèi)外分層嚴重，力學結(jié)構(gòu)差，達不到有序排列的要求，且生長因子的梯度分布也難以實現(xiàn)。
基于此，本研究提出了一種制備纖維結(jié)構(gòu)有序、同時生長因子梯度分布的纖維導管（A/G-PCL）的方案，并通過體外實驗和活體實驗評估了該材料的優(yōu)良性能，最終通過轉(zhuǎn)錄組測序進一步解釋神經(jīng)元趨化生長的分子機制。
實驗方法
首先通過改良的方法制備A/G-PCL導管，然后從體外實驗和體內(nèi)實驗兩方面對其神經(jīng)修復能力進行評估，最后通過轉(zhuǎn)錄組測序手段探索其神經(jīng)修復機制，實驗路線圖見下：
其中6種纖維導管：
R-PCL | 纖維結(jié)構(gòu)無序，無生長因子 |
A-PCL | 纖維結(jié)構(gòu)有序，無生長因子 |
R/U-PCL | 纖維結(jié)構(gòu)無序，生長因子均勻分布 |
R/G-PCL | 纖維結(jié)構(gòu)無序，生長因子梯度分布 |
A/U-PCL | 纖維結(jié)構(gòu)有序，生長因子均勻分布 |
A/G-PCL | 纖維結(jié)構(gòu)有序，生長因子梯度分布 |
實驗結(jié)果
1、制備A/G-PCL導管
在本研究中，作者對靜電紡絲系統(tǒng)構(gòu)建了一個平行負高壓電場，從而實現(xiàn)了有序纖維神經(jīng)導管的一體化制備。在此基礎(chǔ)上，作者巧妙的采用溶質(zhì)濃度與時間雙因素梯度改變的策略，簡單地實現(xiàn)了神經(jīng)生長因子在短距離有序纖維導管中的梯度分布，最終制備出了高度對齊、結(jié)構(gòu)有序、且神經(jīng)生長因子濃度呈現(xiàn)梯度分布的PCL（A/G-PCL）纖維導管（圖1）。
接下來，作者分別從體外實驗和活體實驗兩方面評估了A/G-PCL導管支持神經(jīng)突起定向延伸和坐骨神經(jīng)再生的能力，并通過轉(zhuǎn)錄組測序?qū)ζ浞肿訖C制進行了探索。
圖1 A/G-PCL制造原理圖
2、體外實驗
將SD大鼠的背根神經(jīng)節(jié)（DRG）外植體在R-PCL、A-PCL、R/U-PCL、R/G-PCL、A/U-PCL和A/G-PCL上培養(yǎng)72h，然后進行免疫熒光染色，并測量軸突長度。結(jié)果表明（圖2），DRGs的軸突在無序的PCL纖維上多方向隨機生長，而在有序的PCL纖維上軸突沿纖維方向縱向生長，且在生長因子梯度分布的PCL導管上，DRG神經(jīng)突優(yōu)先向最高濃度的生長因子生長，表現(xiàn)出趨化現(xiàn)象。這些結(jié)果表明，纖維的形貌在指導軸突再生方面起著重要作用，生長因子的梯度分布則促進了軸突顯著的趨化生長。
圖2 DRG神經(jīng)突的生長和取向
3、體內(nèi)實驗
對雄性SD大鼠進行坐骨神經(jīng)切除，留下15mm長的缺損，然后分別植入A-PCL、A/U-PCL、A/G-PCL和自體神經(jīng)段，術(shù)后4周、8周和12周對大鼠進行多指標評估。形態(tài)學評估顯示，A/G-PCL導管在對軸突有更強的縱向引導力，并引起施萬（schwann）細胞的遷移（圖3），另外在術(shù)后第12周，與A/U-PCL導管相比，移植有A/G-PCL導管的大鼠在G比、有髓神經(jīng)纖維的總數(shù)和面積等方面均顯現(xiàn)出優(yōu)勢，說明A/G-PCL導管可顯著促進軸突再生（圖4）；此外，功能學評估表明，與A/U-PCL導管相比，A/G-PCL導管組的大鼠在肌肉萎縮程度、肌肉濕重比、炎癥因子水平、復合肌肉動作電位等指標均表現(xiàn)出明顯改善（圖5）。另外指標均表明，A/G-PCL的表現(xiàn)和自體移植物類似。
圖3 各組術(shù)后再生神經(jīng)形態(tài)學觀察
圖4 免疫組化染色和熒光金逆行示蹤
圖5 腓腸肌masson染色、坐骨功能指數(shù)(SFI)及電生理評價
4、分子機制探索
對在A-PCL、A/U-PCL和A/G-PCL上培養(yǎng)72h后的大鼠DRG提取總RNA，進行轉(zhuǎn)錄組測序。結(jié)果表明，相比A/U-PCL組，A/G-PCL組鑒定到330個上調(diào)基因，277個下調(diào)基因（圖5 A）。對這些差異基因進行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，差異基因顯著富集于“神經(jīng)元投射形態(tài)發(fā)生”、“神經(jīng)遞質(zhì)分泌”、“白細胞遷移”和“細胞因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)”等條目（圖5 C）。KEGG富集分析顯示，上調(diào)基因富集于13條通路，下調(diào)基因富集于6條通路（圖5 D），進一步利用ClueGo對上調(diào)基因進行通路分析，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，從中分析和總結(jié)了三個重要的信號通路，涉及Rap1，MAPK，和細胞粘附分子（圖6）。神經(jīng)元生長錐轉(zhuǎn)向是一個復雜的過程，其中以肌動蛋白為基礎(chǔ)的運動被用來產(chǎn)生持續(xù)和定向的微管前進。另外研究中富集的多種粘附分子可能參與生長錐引導、突觸形成、髓鞘形成和軸突生長。最后挑選與這些通路密切相關(guān)的關(guān)鍵基因進行RT-qPCR驗證，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序一致：A/G-PCL組的表達顯著高于A/U-PCL組（圖5 E）。
圖6 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果
圖7 上調(diào)基因的KEGG網(wǎng)絡(luò)圖
總結(jié)
在本研究中，作者開發(fā)了一種高度對齊、結(jié)構(gòu)有序、且神經(jīng)生長因子濃度呈現(xiàn)梯度分布的PCL纖維導管（A/G-PCL），用以橋接大鼠坐骨神經(jīng)缺損模型中的15mm間隙。體外實驗證明，A/G-PCL可引導軸突的縱向和趨化生長。形態(tài)學和功能學評估顯示，A/G-PCL也促進軸突再生和功能恢復，其表現(xiàn)與自體移植物相似，并優(yōu)于神經(jīng)生長因子均勻涂布的導管。在分子機制方面，轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，A/G-PCL處理可通過19條軸突吸引相關(guān)的信號通路來指導神經(jīng)再生。總之，這些結(jié)果表明，A/G-PCL纖維導管作為自體神經(jīng)移植物的替代品來修復周圍神經(jīng)缺損具有很大的潛力。
本研究的轉(zhuǎn)錄組測序和數(shù)據(jù)分析工作由上海派森諾生物科技有限公司完成。
原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202002610
