2021-04-07
派森諾生物與河南省人民醫院攜手合作于近期在International Journal of Infectious Diseases雜志發表了題為Protein expression shift and potential diagnostic markers through proteomics profiling of tuberculous pleurisy biopsy tissues的文章。
●技術手段：TMT標記定量蛋白組學；PRM定量
研究背景
由結核桿菌(M. Tuberculosis)感染引起的結核病(TB)，是造成世界傳染病死亡的第二大原因。2018年，約有1000萬人被診斷為結核病，導致150萬人死亡。中國是世界上結核病負擔最重的國家之一，占全球結核病例的9%。結核性胸膜炎(或胸膜炎)是結核的一種亞型，它是肺外結核最常見的類型之一，約占中國所有結核病例的25%。
結核性胸膜炎是由間皮細胞、中性粒細胞、CD4細胞、單核細胞、IFN--γ和血管內皮生長因子介導的，因此會增加血管通透性并導致胸腔積液。女性患者癥狀表現為咳嗽、胸痛、發熱、呼吸困難、盜汗、乏力、體重減輕、厭食或月經紊亂。胸腔積液通常是單側的，可以通過胸部X線檢查或CT掃描來診斷。并發癥有胸膜纖維化、胸膜鈣化和肺塌陷，這些都嚴重影響我們的日常生活。因此，了解其發病機制、早期診斷、及時治療和發現可能存在這些并發癥的高危患者是很重要的。
目前對結核性胸膜炎的診斷涉及多個步驟，而且非常耗時。結核分枝桿菌培養或胸膜活檢被認為是診斷的通用標準。研究發現即使結合多種方法，高達25%的結核性胸膜炎患者可能仍未確診。因此需要更靈敏、更特異的檢測方法。
在多個領域中，結核病相關蛋白作為潛在的生物標志物已經被相繼探索。然而由于受到技術手段或靶向檢測的限制，鑒定的蛋白質數量有限。眾多研究表明蛋白質組學在結核病研究和臨床應用方面具有潛力。
迄今為止，還沒有對胸膜活檢組織進行較為全面蛋白質組學分析。因此，本文采用標記定量蛋白組學(TMT-MS)方法對結核性胸膜炎患者和對照組的胸膜組織樣本進行了檢測，并通過PRM方法進一步驗證患者樣本中的高表達蛋白，從而確定新的診斷標志物。
研究思路
研究結果
1. 結核性胸膜炎患者和對照組的整體蛋白表達模式
TMT標記定量蛋白質組學共鑒定到28338個肽段和5101個蛋白質。從主成分分析(PCA)和無監督聚類分析(圖2A和B)可以看出，兩組樣本具有不同的蛋白表達模式。PCA圖中患者與對照兩組間區分的非常明顯，說明兩組之間存在較大差異，無監督聚類分析進一步說明了這一點。蛋白表達密度圖顯示，患者樣本中的低豐度蛋白更多(圖2C)，這在箱線圖(圖2D)中表現得更為明顯。
圖2 A主成分分析 B無監督聚類分析 C各樣本蛋白表達密度圖 D箱線圖 （N為對照，P為患者）
2. 差異表達蛋白和通路富集分析
兩組中共有903個差異表達蛋白（DEPs），其中295個上調蛋白（p <0.05和fold change >2），608個下調蛋白(圖3A)。GO和KEGG富集分析顯示，差異蛋白被富集到多個生物學過程 (圖3B)。顯著富集的KEGG通路包括ECM受體相互作用、補體與凝血級聯反應、黏著斑、病毒性心肌炎和金黃色葡萄球菌感染(圖3C)。由于上調蛋白更有可能代表疾病的進程并作為生物標志物，所以選擇這些上調基因進一步分析。295個上調蛋白被顯著富集在與蛋白質合成和吞噬以及免疫反應有關的KEGG通路中 (圖3D)，這是積極應對結核病感染的跡象。
圖3 A火山圖 B 差異蛋白GO分析 C KEGG通路富集分析 D上調蛋白的KEGG富集通路
3. 通過RPM驗證患者樣本中的top表達蛋白
為了驗證蛋白質組學結果和尋找更可靠的蛋白標志物，本文選擇了19個蛋白質使用PRM方法進行定量。在這19個蛋白中，其中有18個在結核病患者中至少上調了2倍。已知參與TB通路的蛋白(HLA-DQB1、STAT1、FCER1G和CORO1A)也包含在驗證范圍內。選擇一個下調蛋白(TNNC)作為相反的變量。對差異蛋白進一步分析，如表1所示，在PRM驗證中，所有蛋白在患者和對照組之間均有差異表達，且與TMT結果變化方向一致。對照組中幾乎沒有檢測到HIST1H1D、HIST2H3PS2和FCER1G，因此其差異倍數高達400 (圖4)。
表1 PRM驗證
圖4 19個蛋白質的Log2 fold changes（TMT和PRM）
討論
1. 四分之一的結核病患者會發生胸膜炎，其診斷往往具有一定的挑戰性。診斷的標準是細菌的陽性培養，但是它的靈敏度非常低而且用時較長。另一種更準確的方法是活檢和病理檢查，具有典型的變化特征，然而活檢中的非典型病變可能會被漏診。雖然結核病已經研究多年，但仍未對結核性胸膜炎進行全蛋白質組分析。本研究在蛋白質水平的變化及其相關途徑上提供了新的見解。與正常胸膜相比，肺結核患者胸膜中的大部分蛋白表達降低，而與免疫應答相關的蛋白表達顯著增加。并從TMT結果中選擇19個蛋白質進行PRM驗證，證明蛋白質作為潛在生物標志物的可靠性和蛋白質組學檢測的穩定性。
2. 在患者樣本中高表達的18個驗證蛋白中，HLA-DQB1、STAT1、FCER1G和CORO1A曾被報道參與了TB通路。HLA-DQB1在免疫調節中發揮重要作用。STAT1是STAT蛋白家族成員，具有維持免疫平衡的功能。FCER1G是細胞表面的一種蛋白受體，參與過敏等免疫反應。CORO1A是細胞骨架的重要組成部分，在細胞膜的內陷和突起中起重要作用。該蛋白在細胞中的表達可能會阻止分支桿菌的溶酶體傳遞，延長它們在細胞內的生存時間，這是結核病病理學的一個重要特征。
3. TMT蛋白質組學可以檢測到更多的蛋白質：總共5101個蛋白質。這不僅使蛋白譜和通路富集分析更加廣泛，還擴大了生物標志物的搜索范圍。
4. 有研究報道，Ceruloplasmin、C1-inhibitor、lysozyme precursor、gelsolin、clusterin C complement lysis inhibitor和 peroxiredoxin 3在結核液中的表達均高于惡性胸腔液。盡管背景不同，目前研究也發現，除了peroxiredoxin 3 (未檢測到)外，其余蛋白在結核病患者的表達均顯著高于對照組，表明其對TB的特異性。另有文獻報道，SIRPA、PDIA6、AMPH和NFASC在結核性腦膜炎組織中的表達也高于正常腦組織。本實驗沒有檢測到SIRPA、AMPH和NFASC，但發現PDIA6在結核性胸膜炎患者中顯著升高。
5. 標志物的選擇側重于患者樣本中上調的蛋白質，然而下調的蛋白可能在疾病過程中也發揮重要作用。通路分析顯示，這些基因被富集在心肌病/心肌收縮、ECM受體相互作用、補體和凝血級聯反應等多個代謝通路中，表明感染和免疫反應取代了胸膜的正常生理功能。
總結
本研究采用標記定量蛋白組學(TMT-MS)方法對結核性胸膜炎患者和對照組的胸膜組織進行了檢測，結果鑒定到了5101個蛋白，并對兩組間的差異蛋白進行了通路富集分析，最后通過PRM方法進一步驗證患者樣本中的高表達蛋白，從而確定新的診斷標志物。
綜上所述，本文不僅為結核性胸膜炎的分子病理學機制提供了新的見解，而且發現了潛在的診斷標志物。
本研究的蛋白質組學檢測和PRM驗證以及數據分析工作均由上海派森諾生物科技有限公司完成。
