2021-03-24
文章題目：Regulation of circular RNAs act as ceRNA in a hypoxic pulmonary hypertension rat model
技術手段：全轉錄組測序
派森諾生物與昆明醫科大學攜手合作，于近期在《Genomics》上發表了構建大鼠缺氧性肺動脈高壓的ceRNA調控網絡相關研究成果，影響因子6.2。
研究背景
缺氧性肺動脈高壓(HPH)是由于低氧引起血管內皮細胞損傷，血管內皮合成和分泌的各種血管舒張因子平衡失調導致早期的肺血管收縮以及后期的肺血管重建，是慢性缺氧性肺疾病的并發癥，且HPH的發病率逐年上升，在高海拔地區尤為常見。目前HPH預后較差，因此，探索潛在的或新的靶向藥物治療具有重要意義。
環狀RNA (circRNA)是一種特殊的非編碼RNA，其特征是封閉的環狀結構，因此比大多數傳統的線性RNA更穩定。研究表明，circRNA包含多個miRNA結合位點，可以充當miRNA的海綿，從而通過抑制miRNA實現對其下游目標基因的表達調控。這個過程就是競爭性內源性RNA(ceRNA)機制。迄今為止已發現一些circRNA可通過circRNA-miRNA-mRNA的ceRNA網絡在癌細胞的信號調控過程中發揮作用，但其在HPH中的作用和機制尚未得到詳細探討。
基于此，本實驗構建HPH大鼠模型，通過全轉錄組測序技術，結合包括蛋白互作網絡分析、基因功能富集分析等分析方法，構建了circRNA-miRNA-mRNA的ceRNA調控網絡，以探索HPH的潛在關鍵基因。
研究方法
樣本：HPH模型大鼠肺組織、對照組大鼠肺組織
實驗方法：全轉錄組測序
測序平臺：illumina Hiseq
技術路線圖見下：
研究結果
1、全轉錄組測序結果初步分析
對來自HPH大鼠和對照大鼠肺部的6個樣品進行全轉錄組測序。數據標準化后，六個樣品的circRNA、miRNA、mRNA的數據集分布幾乎相同（圖1 A），差異分析結果顯示，HPH組與對照組相比，共鑒定到15個差異circRNA(11個上調，4個下調)、9個差異miRNA(7個上調，2個下調)和212個差異mRNA(141個上調，71個下調)（圖1 B、C）。
圖1 HPH大鼠模型中RNAs顯著表達變化的鑒定
2、ceRNA網絡構建
接下來使用在線工具，對差異miRNA進行靶基因預測。8個差異circRNA(6個上調和2個下調)能夠靶向9個差異miRNA(7個上調和2個下調),另外，這些差異miRNA可以結合46個差異mRNA(27個上調和19個下調)（表1）。根據預測的circRNA-miRNA和miRNA-mRNA關系對，構建了一個ceRNA網絡（圖2 A）。
表1 差異表達RNAs的靶基因
進一步分析該ceRNA網絡發現，circ_002723、circ_008021和circ_016925（上調）與miR-23a（下調）結合，而miR-23a被證實參與了與先天性心臟病和缺氧誘導的人肺動脈平滑肌細胞相關的肺動脈高壓的發展；此外，circ_020581（下調）與miR-21（上調）結合，而小鼠的體內實驗表明，miR-21的基因缺失會導致肺組織中PDCD4/caspase-3軸的功能激活和內皮細胞凋亡的抑制，從而造成進行性HPH的發作。因此，可推測circ_002723、circ_008021、circ_016925和circ_020581具有特異性吸附miR-23a或miR-21，以控制HPH中下游靶基因表達的潛在功能。
3、功能富集分析和PPI分析
使用在線軟件Metascape對ceRNA網絡中的46個差異mRNA進行GO和KEGG富集分析，結果顯示部分富集的條目及通路與HPH相關(圖2 B)：
圖2 ceRNA網絡圖、富集分析網絡圖和PPI網絡圖
A、GO富集顯示，差異基因顯著富集于呼吸系統過程、細胞對高氧的反應、炎癥反應的調節，此外KEGG富集分析顯示，差異基因顯著富集血管平滑肌收縮。已有研究表明，肺動脈平滑肌細胞的異常增殖和遷移會導致肺血管重塑，這是肺動脈高壓病理學的一個重要特征。另外慢性缺氧和炎癥反應可誘導肺動脈平滑肌細胞的增殖和遷移，這被認為是促進HPH的重要因素。
B、同時，差異基因也顯著富集于GO的NIK/NF-κB信號調節、MAPK級聯反應及Toll樣受體條目下，而這三者已被多次報道與HPH密切相關。
C、此外，GO富集分析結果中出現細胞對氧化還原的反應條目，已知氧化劑和氧化還原信號可介導肺動脈缺氧性血管收縮和體循環動脈缺氧性血管舒張，進而參與肺動脈高壓的發展。
D、最后，KEGG富集分析結果中出現BMP信號通路。臨床數據表明，大約11%-40%的特發性肺動脈高壓（PH）的BMPR2基因突變，另外也有報道，抑制BMP蛋白信號通路可以促進HPH的內皮-間質轉化。
另外對ceRNA網絡中的46個差異mRNA進行蛋白網絡互作分析（PPI），發現18個中樞基因（hub-gene），其中MMP8的連接程度最高（圖2 C）。MMP8的富集功能包括細胞因子生成、NIK/NF-κB信號傳導、ROS合成、炎癥反應、MAPK級聯、IL-10產生及腫瘤壞死因子的分泌，且MMP在腫瘤發展中起著復雜且重要的作用，因此MMP8在HPH中扮演的角色有進一步研究的價值。
總 結
本實驗通過對HPH大鼠模型進行全轉錄組測序，構建了一個由8個circRNA、9個miRNA和46個mRNA的組成的ceRNA調控網絡，功能富集表明，炎癥反應、NF-κB信號傳導、MAPK級聯反應和Toll樣受體或與HPH相關。進一步的評估證實，circ_002723、circ_008021、circ_016925和circ_020581可能作為海綿吸附miR-23a或miR-21從而控制下游靶基因，并參與HPH的病理生理學。這些結果可能為臨床提供新的見解和潛在的靶向治療建議。
本研究的測序和數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.ygeno.2020.11.021
