2021-03-10
派森諾生物與南昌大學第一附屬醫院攜手合作于近期在Applied Microbiology and Biotechnology雜志發表了題為Helicobacter pylori infection worsens impaired glucose regulation in high-fat diet mice in association with an altered gut microbiome and metabolome的文章。
技術手段：16S rRNA測序；LC-MS/MS代謝組學檢測
研究背景
幽門螺桿菌感染首先引起慢性胃炎，并導致胃潰瘍和胃萎縮，嚴重者則發展為胃癌。除了胃腸疾病，幽門螺旋桿菌感染還增加了包括糖尿病、代謝綜合征和非酒精性脂肪性肝病在內的代謝性疾病的發病率。此外，有研究表明，殺滅幽門螺桿菌可改善代謝指標，包括降低胰島素抵抗和甘油三酯的含量。
越來越多的研究表明，腸道菌群在肥胖、代謝綜合征和糖尿病等代謝紊亂疾病中發揮著重要作用。除了遺傳背景和環境因素，飲食和抗生素的使用也會嚴重影響腸道微生物群的結構。長時間攝入高脂食物(HFD)會導致優勢腸道菌群多樣性的改變，并提高脂多糖(LPS)的含量，從而導致糖代謝失調。然而，研究發現，抗生素治療對腸道菌群的調節作用可提高HFD小鼠的糖耐量，可能是通過降低細菌數量和脂多糖水平來實現的。研究前期發現，幽門螺旋桿菌感染會加重HFD誘導的代謝紊亂，并導致腸道菌群的一個劇烈變化。但是在HFD組小鼠中，幽門螺桿菌與HFD共同處理引起的糖代謝紊亂是否可以被抗生素逆轉，目前尚不清楚。
除了腸道微生物群，進一步研究發現，微生物的代謝產物還通過作用于消化道內的細胞或進入血液循環來參與宿主代謝的調節，影響機體的遠端部位。然而，關于幽門螺桿菌和HFD在腸道代謝組中的相互作用及其與代謝紊亂的關系目前知之甚少。
本研究的目的是研究幽門螺桿菌感染對HFD引起的代謝紊亂和腸道微生物群以及微生物代謝產物的影響。
研究思路
研究結果
1.感染幽門螺桿菌后，抗生素不能改善因高脂飲食引起的葡萄糖不耐受癥
12周后HFD組小鼠體重明顯高于CD組。有趣的是，抗生素治療降低了HFD小鼠的體重，接近CD組體重水平。然而，無論是CD還是HFD組，幽門螺桿菌感染和非感染之間都沒有差異(圖1b)。與CD組相比，HFD組胰島素抵抗和葡萄糖不耐受增加，但幽門螺桿菌感染組和未感染組沒有差異 (圖1 c-d)。此外，與HFD組相比，HFDHp組的空腹血糖水平明顯升高(圖1e)。與體重類似，抗生素治療也改善了HFD組小鼠的胰島素抵抗、葡萄糖不耐受和空腹血糖，達到與CD組小鼠相等或更低的水平。然而，由于受幽門螺桿菌感染的影響，導致抗生素對HFD引起的血糖失調的改善作用減弱，因此AHFDHp組的葡萄糖不耐受和血糖均高于CD組。
圖1 抗生素處理降低了HFD小鼠的體重，與CD組相比，HFD組胰島素抵抗和葡萄糖不耐受增加。此外, 與HFD組相比，HFDHp組的空腹血糖水平明顯升高。
2.幽門螺桿菌感染與HFD對腸道微生物失調的協同作用
采用16S rRNA測序分析糞便樣品的微生物組成。與HFD組相比，HFDHp組的alpha多樣性指數(包括Chao1和Shannon指數)有所下降，而Hp組與CD組之間無差異(圖2a-b)。beta多樣性， 如NMDS圖所示，不同組之間也有不同程度的差異(圖2c-d)。結果還發現Hp組和HFD組的腸道菌群組成都與CD組不同(ANOSIM, Hp vs CD P=0.007, HFD vs CD P=0.003)。此外，HFDHp和CD組之間的分離比與Hp-或HFD-組之間的分離更明顯。
如圖3a所示，在不使用抗生素的小鼠中，腸道菌群主要由擬桿菌門和厚壁菌門組成。HFD組的厚壁菌門/擬桿菌門的比例增加，而幽門桿菌感染組與未感染組之間無差異。在科水平上微生物的相對豐度在感染組和非感染組也存在差異，尤其是在給予高脂飲食誘導時(圖3b)。
此外，我們進行了LEfSe分析，有趣的是，與幽門螺桿菌感染相關的鑒別特征在CD和HFD兩組中有所不同，這表明幽門螺桿菌和HFD對腸道菌群組成存在相互作用 (圖3c-d)。
圖2 與HFD組相比，HFDHp組的alpha多樣性指數有所下降，而Hp組與CD組之間無差異；對于beta多樣性，不同組之間也有不同程度的差異。
3. 幽門螺桿菌感染和高脂飲食后小鼠腸道菌群對抗生素的不同反應
使用抗生素后，腸道菌群的多樣性和豐富度降低 (圖2a-b)。值得注意的是，在AHFDHp組alpha多樣性進一步降低。使用抗生素后腸道菌群的組成發生了很大的變化，變形菌門占很大比例，擬桿菌門和厚壁菌門幾乎消失(圖3a)。
圖3幽門螺桿菌感染與HFD的協同作用共同影響小鼠腸道微生物的組成
與AHFD組相比，AHFDHp組的某些功能也發生了變化，包括代謝疾病、感染病以及多糖生物合成和代謝的增加 (圖4c)。結果還發現，AHFDHp組的糞便微生物中與LPS生物合成相關的微生物基因功能明顯更高，而與碳水化合物代謝相關的基因功能較低(圖4d)。因此，幽門螺桿菌和HFD共同處理引起的腸道菌群失調對抗生素的破壞更為敏感，可能會削弱其對代謝紊亂的改善作用。
圖4 幽門螺桿菌感染組和未感染組在level 2和 level 3層級上的差異富集通路
4. 幽門螺桿菌感染對不同組別的小鼠糞便代謝物的影響
為確定感染幽門螺桿菌后代謝物的變化，對感染組和對照組的糞便樣本做LC-MS非靶向代謝分析。經過數據處理之后，正離子模式下檢測到148,907個峰，負離子模式下檢測到48,966個峰，共鑒定出1343個代謝產物。OPLS-DA分析表明組內樣本重復性以及組間區分效果都比較好(圖5 a-c)。而且在不同的處理組中，幽門螺桿菌感染引起的代謝產物的變化是不同的。如圖5d-f所示，對3個比較組中差異的代謝物繪制熱圖（差異代謝物的篩選標準為VIP值>2和P值<0.05）。
差異主要表現在脂肪酸、膽汁酸、氨基酸、肽及其類似物、維生素D及其衍生物、二萜類化合物等代謝物中(圖6)。
圖5 OPLS-DA分析以及差異代謝物熱圖分析
圖6 差異代謝物的箱線圖
為了進一步確定幽門螺桿菌感染后影響的通路，我們對差異代謝物進行KEGG通路富集分析。如圖7a所示，在CD組中，被幽門螺桿菌感染后脂肪消化吸收和不飽和脂肪酸的生物合成通路受到影響。與HFD組相比，在HFDHp組中上調的L-phenylalanine被富集在苯丙氨酸代謝通路上(圖7b)。抗生素處理后，發現HFDHp和HFD比較組中有8個差異代謝物包括膽堿、肌酸、L-3-hydroxykynurenine和維生素D3參與到代謝通路中 (圖7c)。同時，膽堿和肌酸也富集在甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝通路上，這表明在HFD和抗生素干預后，這兩種代謝物在幽門螺桿菌引起的代謝紊亂中具有潛在的作用。
圖7 差異代謝物的KEGG通路富集分析
總結
綜上所述，本研究揭示了幽門螺桿菌、HFD和抗生素在葡萄糖代謝中的相互作用及其對腸道微生物群和代謝產物的影響。幽門螺桿菌感染削弱了抗生素對HFD誘導的代謝紊亂的調節作用，這可能是由于腸道微生物多樣性低且克雷伯氏菌單一優勢所致。研究還發現幽門螺桿菌感染后腸道代謝產物發生改變。結果表明，幽門螺桿菌感染削弱了抗生素的修復作用，加劇了食用高脂食物對腸道微環境穩態的影響。
本研究的微生物組測序和代謝組學檢測以及數據分析工作由上海派森諾生物科技有限公司完成。
