2020-11-20
發表期刊《Food Chemistry》
影響因子：6.306
派森諾在宏轉錄組學研究領域已積累了豐富經驗。繼去年與黑龍江八一農墾大學合作，在《Bioresource Technology》（影響因子：7.539）發表研究成果后【派森諾項目文章】宏轉錄組研究強勢登錄BT?。c擊查看），我們近期與沈陽農業大學合作，并在《Food Chemistry》（影響因子：6.306）發表研究論文。
在這項研究中，作者成功地從大醬樣本中提取了微生物組總RNA，并運用宏轉錄組測序技術，解析了不同發酵階段活性菌群的結構和功能，同時還檢測了整個發酵過程中生化指標和風味成分的變化。最后，通過微生物組——生化指標——風味成分的聯合分析，確定了大醬發酵過程中香味產生的作用機理和關鍵微生物成員。
研究背景
大醬是東北傳統制作的自然發酵豆醬，因其風味與高營養價值而成為調味佳品。目前的研究顯示，大醬的風味與微生物群落的作用有密切關聯。目前的研究大多基于發酵過程中微生物產生的代謝物和風味誘導化合物進行解析，但驅動發酵過程的微生物群及其與主要風味代謝物的相關性仍有待闡明。之前的研究也主要在DNA層面上對發酵豆醬微生物群落的物種組成、豐度和代謝潛力進行了研究，而無法確定這些微生物是否確實在發酵過程中起作用，也沒有確定在發酵或賦予風味中起關鍵作用的重要微生物群。
宏轉錄組測序，可以針對大醬中的活性微生物群落進行研究，將細菌、真菌等各種類的活性菌群一網打盡，并找出活躍表達的基因，從而揭示相關微生物的群落結構與功能的變化，非常有利于確定在發酵或賦予風味中起關鍵作用的微生物物種。因此，本研究利用宏轉錄組測序對大醬中的微生物群落結構與功能進行了深入研究。
研究目的
研究發酵過程中活性微生物群落、生化指標和風味物質的變化及相互關系，進而確定在發酵或賦予風味中起關鍵作用的核心微生物。
材料與方法
測序技術：Illumina HiSeq高通量測序平臺
測序模式：宏轉錄組測序
研究結果
① 首先，對不同發酵階段的大醬樣本進行宏轉錄組測序，解析大醬中的活性菌群組成和功能特征。
●大醬中的活性菌群結構
如圖1所示，豆醬中的優勢微生物主要屬于厚壁菌門（95.2%），主要屬為四聯球菌（60.7%）、乳桿菌（19%）、葡萄球菌（6.4%）、海洋桿菌（2%）和腸球菌（1.4%）。
有趣的是，一些真菌屬和病原菌，比如酵母屬、曲霉屬、毛霉屬，以及葡萄球菌，在發酵初期也很豐富，但隨著發酵的進行而減少，這些菌很可能是在早期被引入或者只在初期發揮作用，但對液態醬的發酵過程沒有顯著影響。
圖1 不同發酵時間下，門水平（a）和屬水平（b）的活性微生物群落結構變化
● 大醬中正在表達的功能信息
宏轉錄組Unigenes的KEGG代謝數據庫注釋結果顯示，代謝相關的基因豐度是高的，在初始階段即高達41.7%，在后續發酵過程中快速增加至54.1%，并在58%左右保持穩定。同時，代謝相關的基因主要集中在碳水化合物代謝上，呈現出先快速增加，再略微下降，而后又增加的趨勢。有趣的是，這一趨勢與四聯球菌的相對豐度一致！
結合CAZy數據庫的注釋結果，研究發現，以糖苷或寡糖鍵為目標的糖苷水解酶在發酵中期（H14-H28）高度活躍。碳水化合物和氨基酸代謝也在此期間也達到高峰，與微生物群落結構的快速變化相一致，這可能和風味的形成有很大關聯。
圖2 KEGG一等級與二等級注釋結果
② 隨后，采用頂空固相微萃?。℉S-SPME）、結合氣相色譜-質譜（GC-MS）和自動氨基酸分析，檢測整個發酵過程中生化指標（亞硝酸鹽、鹽度、pH、色澤）和風味成分（揮發性風味物質、游離氨基酸）的變化。
● 大醬發酵過程中的代謝物變化
如表1所示，在豆醬中檢測到10種主要的風味相關成分，包括2種醇、3種酯、2種酸和酚以及3種醛和酮。在早期發酵階段（H0）僅檢測到少量化合物，表明大多數揮發性物質可能是在液態醬的發酵過程中產生的。
同時，發酵醬中共檢測到17種游離氨基酸，根據味道特征，將其分為鮮味、甜味、苦味和無味。這些氨基酸隨著發酵的進行而穩定增加，并在發酵結束階段達到最高。
表1 不同發酵時期主要揮發性成分的組成和含量
表2 不同發酵時期氨基酸的組成和含量
③緊接著，通過關聯分析確定產生香味物質的標志微生物（Biomarker）。
● 微生物群落與理化性質和代謝產物的相關性
RDA冗余分析顯示（圖3），鹽度、pH、色澤是發酵過程中菌群變化的重要影響因素。同時，發酵后半段（H28、H42和H56）的大醬微生物群落更接近，多數微生物彼此之間呈正相關性，與pH值也呈正相關，只有四聯球菌、海洋桿菌和庫爾特氏菌與pH值呈負相關，它們可能對亞硝酸鹽的產生有抑制作用。同時乳酸桿菌和四聯球菌豐度的增加與色度呈正相關，乳酸桿菌豐度的增加與鹽濃度呈正相關。這些結果顯示，發酵豆醬中的常駐微生物具有鮮明的生理特征，能夠適應不斷變化的環境。
圖3 RDA冗余分析
Spearman關聯網絡分析進一步表明，微生物和代謝物之間存在顯著的相關性。如圖4所示，有24個細菌屬，8個真菌屬，都與代謝物存在顯著相關性。它們有的和游離氨基酸的產生顯著相關，有的和一些揮發性成分顯著相關，而揮發性酯、乙酸和苯甲醛這類揮發性成分對大醬的風味至關重要。關聯網絡分析直接表明，四聯球菌和乳酸桿菌分別與苯甲醛和冰醋酸呈正相關。此外，乳桿菌和一些腸球菌科微生物與揮發性酯呈顯著正相關，表明它們在豆醬發酵過程中直接或間接參與脂質代謝。賴氨酸芽孢桿菌、葡萄球菌和蜜蜂球菌也與鮮味氨基酸呈正相關，可能有助于大豆醬鮮味的提升。
圖4 “微生物組—代謝物”的Spearman關聯網絡分析
最后，根據上述活性微生物、功能、理化性質、代謝物檢測及關聯分析的結果，深入分析，并得出結論：乳酸桿菌與四聯球菌是影響色澤和風味的核心菌屬，它們產生的酶催化一系列代謝途徑，從而產生風味物質！
總 結
本研究利用宏轉錄組測序、HS-SPME-GC-MS和氨基酸分析方法，解析了大醬菌群和發酵物代謝譜隨時間的變化，并鑒定出10種有助于大豆醬風味形成的揮發性化合物。此外，還進一步分析大豆醬中活性微生物與理化特性和風味物質之間的相關性，結果表明，乳桿菌屬和四聯球菌屬是影響色澤和風味的重要屬。這些微生物產生的酶催化一系列代謝途徑，從而產生風味物質。該研究的發現為菌群在發酵食品風味形成中的作用提供了新的見解。
本研究的測序和數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
文章索引：
Feiyu An, Mo Li, Yue Zhao, et al. Metatranscriptome-based investigation of flavor-producing core microbiota in different fermentation stages of dajiang, a traditional fermented soybean paste of Northeast China[J]. Food Chemistry, 2020: 128509.
點擊閱讀原文：
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0308814620323712
