2020-11-03
發表期刊：《frontiers in Microbiology》
影響因子：4.235
近日，派森諾生物與河海大學攜手，在微生物基因組領域的《frontiers in Microbiology》（影響因子4.235）發表研究成果！
研究背景
瓊脂是許多紅藻細胞壁的主要成分，是一種復雜的水溶性多糖，由瓊脂糖和瓊脂多糖組成。瓊脂糖是由重復的D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖單元通過α-1，3-和β-1，4-糖苷鍵連接而成的線性大分子，而瓊脂糖素是瓊脂糖的衍生物，其重復單元是甲基化、丙酮化、磺化或糖基化的半乳糖部分。瓊脂酶是一種重要的瓊脂裂解酶，參與從瓊脂糖中生產寡糖或單體糖。產生瓊脂酶的細菌大多來自海洋環境，這些細菌在分類上屬于不同的屬，如假單胞菌、類單胞菌等。雖然瓊脂利用在弧菌物種中不是特別普遍，但已經從不同的瓊脂分解弧菌菌株中純化并鑒定了瓊脂酶。
弧菌是革蘭氏陰性專性異養細菌，以自由生活群體或與多種水生生物共生的形式棲息在海洋和河口環境中，這是一個多樣化的屬，有超過120個已確認的種。一些弧菌對海洋動物和人有致病性，而大多數弧菌是非致病性的，是海洋微生物群落的正常組成部分。已知弧菌物種使用復雜的有機碳水化合物，如多糖(纖維素、甲殼素和瓊脂等)作為碳和能源，并在環境碳循環中發揮重要作用。
研究材料與方法
菌株分離
檸檬酸硫代硫酸鹽膽汁鹽蔗糖(TCBS)平板分離了150株弧菌，其中3株進行了瓊脂糖降解活性的表型試驗，活躍的菌株HN897進行高通量測序和基因敲除實驗進行驗證。
測序平臺
Illumina Miseq+Pacbio RSII
研究結果
01、菌株HN897的基因組特征
通過二代測序和三代測序組裝得到兩個完整的環狀染色體，其基因組特征為Vas1（染色體1）大小3,120,326bp，GC含量46.06%，預測到2801個CDS、110個tRNA和34個rRNA，NR注釋到2736個基因；Vas2（染色體2）大小1,679,007bp，GC含量44.82%，預測到1487個CDS、6個tRNA和16個ncRNA，NR注釋預測到1420個基因；其中兩條染色體的NR注釋結果中的基因有一般比對上Vibrio sp.C7基因組上。
02、菌株HN897的分類歸屬
根據GTDB，所有205個弧菌科代表中組成了一個單系科級群（圖A）；根據NCBI分類，弧菌科的分類單元是弧菌目，但經過分類等級歸一化后，GTDB分類將其重新歸類為腸桿菌。但在進化樹中HN897與140個弧菌成員分支在弧菌科亞樹中，準確的來說，與星狀弧菌菌株C7是統一個亞類（圖B），ANI分析發現兩個的相似性高達96.6%，進一步說明兩株菌的親緣關系較近。對這兩株菌進一步進行比較發現，相似性高的區域包含了染色體的大部分編碼區域（Vas1的CDS占95.5%，Vas2的CDS占77.2%）(圖C、D)。
03、HN897的功能注釋
Kegg注釋總共得到2344個基因，有634個基因與代謝途徑有關，特別是合成代謝類的；還有很多基因與不同的細胞信號通路有關，包括ABC轉運蛋白通路、雙組分系統和群體感應系統，且有一組參與碳和丙酮酸代謝以及糖酵解/糖異生作用的基因成分似乎相對完整。Pfam預測發現基因組的CDS至少有一個Pfam模型，豐富的結構域是鈣粘蛋白_5，有116個命中，其中111個排列在長的CDS上；ABC轉運結構域、信號轉導相關的結構域也比較豐富。此外HN89經過碳水化合物預測發現得到一些相關基因并確定了碳水化合物結合模塊（CBM）。
04、菌株HN897的β-瓊脂酶基因譜
研究發現，β-瓊脂酶8個GH亞家族成員與相似，其中HN897的GH16和GH50家族也包含在內。為了驗證這一關系，基于72個GH蛋白序列的保守酶結構域構建進化樹，結果顯示所有的GH在GH亞家族水平上是一致的，進而將得到的8個β-瓊脂酶歸入GH50和GH16亞類（圖A）。已鑒定的N末端疏水信號肽表明，GH50和GH16的成員都可能是分泌型的（圖B）。
HN897的8個β-瓊脂酶基因區域的基因簇與45個基因組的同源性分析表明，GH16s和GH50s代表兩組可能起源相似的同源排列基因。不同的是VAS1_1339，它位于與其他GH16不同的染色體上。除了缺少一個GH50基因、幾個生長素亞家族基因普遍存在移碼以及部分基因存在倒位、異位和重排外，HN897和C7之間共線性總體是一致的(圖C)。
05、Vas1_1339-瓊脂分解表型的功能驗證
對HN897的8個可能β-瓊脂酶基因分別構建了敲除菌株組，瓊脂斑點試驗表明，其中7個菌株組的缺失突變體和野生型菌株相似（圖A），Vas1_1339缺失株（△1339）的瓊脂糖裂解酶活性喪失，但該基因在反式表達中恢復了瓊脂糖裂解表型。酶活性測定發現△1339菌株培養上清液中瓊脂酶活性明顯低于野生型菌株和補充型菌株（圖B）
使用PaperBLAST比對發現，Vas1_1339與弧菌V134菌株的一個半乳糖-瓊脂酶基因agaV相似，只有兩個氨基酸殘基的差異。構建16S rRNA進化樹發現V. astriarenae菌株（C7, C20,和推測的HN897）與V134相近，表明HN897菌株很可能為V. astriarenae。
研究結論
1.通過高通量測序獲得HN897的完整基因組序列，預測發現該菌株可能存在豐富的糖苷水解酶；
2.通過序列聚類和蛋白質結構域結構的比較，鑒定了8個可能的β-瓊脂酶編碼基分別屬于GH50和GH16家族；
3.基因敲除和互補實驗證明，GH16-16型β-瓊脂酶編碼基因Vas1_1339對于HN897菌株的瓊脂糖表型是不可少的；
綜上所述，這些結果不僅為理解細菌瓊脂糖解的生化機制提供了依據，也為更詳細地了解V.astriarenae HN897基因組的進化和生理功能提供了依據
本研究的denovo測序工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
文章索引：Liu, Yupeng Jin, Xing-Kun Wu, Chao Zhu, Xinyuan Liu, Min Call, Douglas Zhao, Zhe. (2020). Genome-Wide Identification and Functional Characterization of β-Agarases in Vibrio astriarenae Strain HN897. Frontiers in Microbiology.
