2020-10-28
發表期刊：Journal of Hazardous Materials
影響因子：9.038
文章題目：Transcriptomic analysis of Raphidocelis subcapitata exposed to erythromycin: The role of DNA replication in hormesis and growth inhibition
技術手段：RNA-Seq
派森諾生物與西北大學攜手合作，于近期在Journal of Hazardous Materials上發表了紅霉素對羊角月牙藻毒理學機制的研究成果，影響因子9.038分。
研究背景
在藥品上市申請過程中，往往通過受試藻類的半濃度效應（EC50）來評估該藥品毒性閾值和環境危害表征。但此類毒性測試經常采用遠高于環境中檢測到的藥物濃度，而生態毒理學方面的進展已經從研究高濃度污染物的急性毒性轉移到研究環境相關暴露的慢性影響，導致人們更多地關注受試藻類基因表達模式的變化。基于NGS的RNA測序技術允許量化全基因組水平的基因表達，然而目前這種方法還沒有應用于闡明藻類長期暴露于藥物的分子機制。
紅霉素（ERY）是一種常用的治療呼吸道感染的大環內酯類抗生素，鑒于其對藻類的潛在環境危害和風險，ERY已被列入歐盟水框架指令的觀察名單。由于羊角月牙藻已有完整的基因組測序結果，且可被ERY引起毒物興奮效應，因此它們可作為闡明抗生素在水藻中的作用機制的代表。
研究方法
將羊角月牙藻分別暴露于4種不同濃度的ERY中，并命名為對照組（0μg/L）、低ERY組（4μg/L）、中ERY組（80μg/L）和高ERY組（120μg/L）。暴露實驗進行7天，分別于2、4、7天對各組進行細胞數統計，于第7天收集各組的羊角月牙藻進行轉錄組測序，并基于測序結果，挑選關鍵差異基因進行RT-qPCR驗證。
研究結果
1、暴露于ERY后，羊角月牙藻的生長狀況
ERY對羊角月牙藻生長的影響如圖1所示。與對照組相比，低ERY組的羊角月牙藻生長在7d的ERY處理中被檢測到明顯的毒物興奮效應，表現在細胞密度提高21.9%。然而，在中、高濃度組，羊角月牙藻生長呈劑量依賴性下降，細胞密度被顯著抑制了52.0%和65.4%。
圖1. 7天實驗中羊角月牙藻的生長曲線
2、差異表達基因
在羊角月牙藻中共檢測到13384個轉錄本(圖2A)。就各組基因表達模式而言，三次重復的相關系數約為0.99(圖2B)，具有顯著的高相關性。與此同時，PCA分析顯示，對照組和低ERY組的基因表達簇與中、高處理組的基因表達簇有所區別(圖2C)，這與heatmap檢測結果一致(圖2D)。與對照組相比，低ERY組鑒定出218個差異基因(198個上調，20個下調)，中ERY組鑒定出950個差異基因(332個上調，618個下調)，高ERY組鑒定到2896個(1299個上調，1597個下調)(圖2E)，有趣的是，低ERY組的大多數差異基因上調表達，而中、高ERY組的大多數差異基因下調表達。
圖2. 暴露于ERY7天后，羊角月牙藻的轉錄組分析
3、GO、KEGG富集分析和轉錄因子分析
GO分析是為了研究受ERY影響的基因在CC、MF和BP中的作用。簡單地說，在低ERY組中，顯著富集的GO條目與DNA復制過程相關；在中ERY組中，顯著富集的GO條目與葉綠素代謝有關；高ERY組的差異基因主要富集于葉綠素代謝和DNA復制方面的GO條目。因此，可認為這些生物學過程在ERY對藻類生長的抑制中發揮了重要作用。
在KEGG功能途徑和轉錄因子水平上，與GO富集結果一致，ERY處理也會影響與DNA復制和葉綠素代謝過程相關的途徑(表1)。
表1. ERY處理影響的關鍵通路列表
討論
通過分析轉錄組的差異基因及KEGG富集分析結果，可得出一種推測：ERY處理干擾了葉綠素a合成、碳同化、氧進化和氧化應激相關的信號通路。與這一假設相一致的是，光合生物體的碳固定以及卟啉和葉綠素代謝途徑在中、高ERY中分別受到了上下調節。在高濃度下，ERY進一步抑制了參與I期、II期和III期異種生物代謝、類固醇、維生素和脂肪酸生物合成的幾個基因的表達，并誘導了負責清除活性氧(ROS)的基因。特別地，DNA復制信號通路在低ERY和高ERY處理組中存在相反的差異表達情況。作者將差異基因按照參與不同生化反應進行分類，進行具體討論。
點擊展開
A 與異種生物代謝有關的基因
在藻類中，外源生物經歷了I、II和III期代謝過程，這是一種解毒作用。在本研究中，參與I期、II期和III期代謝的基因的表達水平在中、高ERY處理組中均持續受到抑制。具體來說，參與解毒系統I期的Cyt P450、ABHs和AOs在中、高ERY組中均下調；參與解毒系統II期的GST僅在高ERY組下調表達；參與Ⅲ期-胞吐作用的ABC轉運蛋白家族基因在不同濃度處理組中被抑制。
B 與脂質代謝和氧化應激相關的基因
脂肪酸和酮體是乙酰輔酶a代謝的兩個主要過程。在高ERY組中，下調差異基因富集于脂肪酸生物合成途徑，而上調差異基因富集于酮體合成途徑。這表明，ERY阻礙了乙酰輔酶a向長鏈脂肪酸的轉化。
氧化應激方面，高ERY組中mvp17和sod2基因上調表達，這二者是抗氧化系統中的生物標志物，上調表達可導致羊角月牙藻中ROS含量增加。此外，高ERY組中檢測到過氧化物酶基因：pex2、pex10和pex19上調表達，說明ERY可通過誘導這類基因從而促進過氧化物酶體的生物發生。
C 與DNA復制和修復有關的基因
在高ERY處理組中，參與DNA復制過程的多個基因的表達被抑制，下調基因包括解旋酶的mcm2、mcm3、mcm6，參與復制叉形成和引物結合的pcna、rfc1、rfc2_4 rfc3_5，以及參與伸長的pola1、pri2、pold1、pold2。與此相反，在低ERY組的羊角月牙藻中，參與DNA復制的5個基因：mcm2、mcm6、pri2、pole2和rnaseh2a上調表達。這與表型實驗的結果一致，說明DNA復制是化學試劑藻類毒性試驗中經常檢測到的毒物興奮效應的分子機制。
此外，高ERY組的KEGG富集分析結果顯示，由于有10個下調的差異基因富集，DNA復制錯配修復通路被抑制，據此推測ERY的毒性機制可能與其有關。
D 與碳固定有關的基因
羊角月牙藻的生物固碳有C3和C4兩個途徑，在本實驗中，中、高ERY組中的alt均下調表達，從而提高C3途徑的CO2濃度，促進葡萄糖的生成。此外gapa、rpe、pgk的上調表達也有助于提高CO2的吸收效率。
E 與光合色素和生物素合成有關的基因
光和色素方面，中、高ERY組中的葉綠素a合成量可能降低，因為該通路中幾個關鍵酶的表達明顯降低：chIH、bchM、chIE、dvr、por。然而，不同濃度ERY處理下，參與葉綠素b和類胡蘿卜素生物合成途徑的基因沒有明顯改變，表明ERY對它們的合成沒有不良影響。
生物素代謝方面，高ERY組的fabF、fabZ和fabI基因下調表達，它們可通過下調參與Pimeloyl-ACP合成的基因來抑制生物素的合成；與此同時，hlcs上調表達以彌補生物素的損失。由于生物素是參與脂肪酸合成中的酶的輔助因子，因此ERY可能通過抑制生物素代謝來抑制脂肪合成。
F 與甾體生物合成相關的基因
萜類主鏈生物合成和倍半萜和三萜生物合成是甾體生物合成的兩條前體途徑。在中ERY組中，參與萜類主鏈生物合成非甲羥酸途徑的fdps和ispE下調，與此相一致，高濃度的ERY也抑制了4個基因的表達。
文章小結
本文研究了紅霉素(ERY)對藻類生長和轉錄組的影響，發現DNA復制通路的誘導可能與藻類的毒物興奮效應有關，與DNA復制相關的基因在80和120 μg/L的ERY中均有下調，另外碳固定、葉綠素a合成和脂肪酸途徑受到干擾，具體見下圖：
本研究的測序和數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
原文索引：
Guo J , Ma Z , Peng J , et al. Transcriptomic analysis of Raphidocelis subcapitata exposed to erythromycin: The role of DNA replication in hormesis and growth inhibition[J]. Journal of Hazardous Materials, 2020, 402:123512.
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https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2020.123512
