2020-10-15
近日，派森諾生物與上海交通大學攜手，在微生物基因組領域的《Journal of Hazardous Materials》發表研究成果！
影響因子 9.038
研究背景
多環芳香烴是由兩個或者兩個以上苯環組成的有機污染物，如萘和芴。雜環芳香烴是由其他元素組成環狀結構的化合物，如二苯并呋喃（DBF）和二苯并噻吩（DBT）。多環芳香烴和雜環衍生物主要是由化石和固體生物燃料不燃燒、高溫工業過程和煉油廠廢水中產生。自2003年以來，已產生了約11.6萬噸多環芳香烴，造成環境污染并威脅人類健康。芴是一種毒性很強的三環芳烴，其雜環衍生物（DBF和DBT）通過呼吸或直接接觸皮膚對人類造成嚴重的健康威脅，如可導致畸形、癌癥、基因突變和染色體畸變。
考慮到多環芳烴的物理和化學處理是能源、成本、化學密集型的，甚至會造成二次污染；生物修復是生態友好的和可持續發展的，在過去的20年中得到了相當大的關注。前人報道的幾種能利用芴、DBF或DBT的微生物僅利用這些污染物中的一種作為唯一的碳源，或通過與其他化合物共代謝來降解DBF/DBT，很少有菌株能夠同時降解這三種化合物。雖然已有文獻報道了DBF和DBT降解的幾個關鍵基因和酶，但目前對芴、DBF和DBT完整的分解代謝途徑及相關降解基因的認識還很缺乏。
研究材料與方法
1）菌株分離與鑒定
菌株來源：從天津多環芳烴污染和石油化工污染的土壤和泥漿中分離得到Pseudomonas sp. MPDS菌株（可利用芴、DBF、DBT進行生長）；
鑒定：設計16SrRNA引物，并用MEGA 5.2.2 構建進化樹。
2）多環芳烴及其雜環衍生物的培養和降解條件：對不同的底物、溫度、轉速和底物添加量進行了檢測。
3）測序
①基因組Illumina MiSeq 和 PacBio
②轉錄組：Illumina
4）RT-qPCR分析：檢測萘基因簇中6個基因和16S基因。
研究結果
菌株MPDS的分離與鑒定
分離得到一株降解多環芳烴和雜環衍生物（包括萘、芴、二苯并呋喃、二苯并噻吩）的菌株MPDS。MPDS菌株的16S rRNA基因與油菜假胞單菌的16S rRNA基因的同源性為99%，系統發育樹顯示的結果也接近。這種已鑒定的MPDS菌株對包括氯霉素、氨芐青霉素和卡那霉素在內的多種抗生素具有抗藥性。
萘、DBF、DBT和芴的生長條件及降解能力
為了確定4種底物的生長條件和降解能力，對好氧菌株MPDS在不同轉速、不同溫度、不同萘、芴、DBF和DBT用量下進行了培養。結果發現MPDS菌株在高溫下幾乎不生長，生長溫度為25℃，生長轉速為200rpm，萘用量遠高于DBF、DBT和芴（與菌株MPDS對萘的降解能力較強有關）。在條件下，對菌株MPDS的降解能力進行了檢測，發現其能在84h內完全降解50mg萘，96h可降解65.7%的DBF(5 mg/50mL)和32.1%的DBT(5 mg/50mL)，72h可降解40.3%的芴(5 mg/50mL)。
菌株MPDS的基因組分析
MPDS菌株組裝出1條環狀染色體，基因組大小6,213,959bp，GC含量為60.25%，有5534個編碼基因，5個rRNA操縱子和65個tRNA基因。在基因組的27933kbp區域預測得到編碼多環芳烴和雜環芳烴降解的基因，包括負責萘降解的必要基因, 推測基因nahBFCED參與順式萘二氫二醇向水楊酸的轉化。在基因組注釋的基礎上，該菌株還發現了其他芳烴降解基因，包括4-羥基苯甲酸-3-單加氧酶、4-羥基苯乙酸異構酶和3-苯丙酸雙加氧酶(HcaE)。這些酶的底物均為單苯環化合物，推測它們參與了多環芳烴降解過程中下游代謝產物的降解。同時還預測了一些功能基因，這些基因可能在利用硝酸鹽、合成氨基酸、轉移和吸收含C化合物方面是必不可少的。
萘、DBF、DBT和芴生物降解途徑的研究
1）萘降解途徑
用LC-MS鑒定了萘降解中間產物的降解途徑，1，2-二羥基萘、水楊酸和鄰苯二酚分別出現在4.200min、3.152min和3.834min，質譜m/z值分別159.0456、137.0247和109.0304 (圖A)。因此，推測萘的降解途徑是水楊酸途徑(圖B)。
2）DBF降解途徑
從DBF的發酵樣品中檢測到新的中間峰，包括3-(3‘-氧基苯并呋喃-2’-基)丙酸、2-(3‘-氧基苯并呋喃-2’-基)乙酸等（如圖F）。但DBF側向雙氧水降解途徑中產生的黃色毒性中間代謝物HOBB尚未被鑒定。故制備了HOBB作為靜息細胞反應的唯一底物，結果顯示菌株MPDS在45小時內降解了0.2 mm HOBB，表明菌株MPDS可以通過側向雙氧降解途徑降解DBF，解決了該途徑通常被HOBB阻斷的問題。同時用GC-MS在11.097min檢測到硅基化水楊酸 (圖G)。表明菌株MPDS具有DBF的側向雙加氧途徑，第一步是將DBF水解為HOBB，然后降解為水楊酸(圖H)。
3）DBT降解途徑
采用LC-MS檢測到DBT側向降解途徑中的典型產物：1，2-二羥基二苯并噻吩、3-羥基-2-甲酰基苯并噻吩、2，3-二羥基苯并噻吩和硫代水楊酸(圖I)。這些中間體分別出現在18.513min、3.018min、3.800min和2.918min，質譜m/z數據分別為215.0176，177.0024，165.0065和153.0013 (圖I)。同時，GC-MS(衍生化后)在12.692min檢測到硅烷化的硫代水楊酸(圖J)。這些結果表明，菌株MPDS通過側向雙加氧途徑將DBT降解為硫代水楊酸(圖k)。
4）芴降解途徑
用LC-MS法從熒烯樣品(圖C)分別在7.179min、3.217min和3.217min鑒定出9-熒醇、2-丙酸-1-吲酮和2-乙酸-1-吲酮。此外，用GC-MS(衍生化后)在12.951min檢測到了9-熒酮的相關代謝物(圖D)。因為9-熒醇和9-熒酮是角雙加氧途徑的代謝物，2-丙酸-1-吲哚和2-乙酸-1-吲酮屬于側向雙加氧途徑，故推測菌株MPDS可能同時含有角狀和側向的雙加氧途徑(圖E)，但降解芴的代謝途徑仍有待進一步研究。
總之，在菌株MPDS中，DBF、DBT和芴的生物降解是通過側向雙氧合途徑進行的，而這種途徑通常存在于共代謝菌株中。在MPDS菌株基因組中未發現類似的DBF、DBT或芴降解基因。因此，推測菌株MPDS可能攜帶了DBF、DBT和芴降解的側向雙氧合途徑的新的代謝基因簇。
轉錄組分析
以DBF為轉錄組數據分析的基質，來尋找潛在的降解基因簇；數據分析發現陰性對照組(1%甘油培養)和實驗組(DBF培養)有870個基因在表達水平存在差異，通過聚類分析確定了具有相似表達水平的基因(圖B)。KEGG途徑富集分析發現，差異表達基因主要與纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解、乙醛酸和二羧酸的代謝以及丙酸的代謝途徑有關(圖C)。
結合之前分離并報道了另一株降解DBF的假單胞菌株FA-HZ1，對這兩株菌株的基因組序列進行了聯合分析發現這兩株毒株在249個基因中具有較高的序列同源性(80%以上)。此外，還發現了13個序列高度相似的基因，這些基因在MPDS株的轉錄組數據中上調。
萘基因簇的實時定量PCR(RT-qPCR)
根據基因組數據和轉錄組數據發現菌株MPDS中存在一個萘降解基因簇，其中 nahAa、Nahab和nahAc的表達上調。為了確定該基因簇在萘降解中的作用，對位于萘降解基因簇上游和下游的參考基因以及相關基因進行了實時定量PCR。結果顯示：NaHA和NAHB的表達分別是對照組(甘油)的37.8倍和42.2倍、nahh上調36.1倍。而編碼水楊醛脫氫酶、2-羥色烯-2-羧酸異構酶和乙醛脫氫酶的3個基因(nahf、nhd和naho)則沒有明顯上調。由此說明菌株MPDS萘基因簇中的一些基因可能是由萘或其中間代謝產物誘導表達的，但也有一部分是結構性表達。
研究結論
1）假單胞菌菌株MPDS能夠利用萘、芴及其雜環衍生物DBF和DBT作為生長的唯一碳源，并能通過側雙氧代謝途徑對芴、DBF和DBT進行生物降解；
2）測定了菌株MPDS的降解能力，闡明了四種底物的降解途徑，鑒定了萘降解的功能基因，并分析了潛在基因的基因組序列和轉錄組數據；
3）對菌株MPDS的基因組和轉錄組進行了分析，發現了一個萘降解基因簇，命名為nahAFBCED；
4）菌株MPDS和另一種DBF降解菌的比較基因組分析揭示了潛在的DBF降解基因；
綜上所述，此研究結果進一步了解了萘、蒽、DBF和DBT生物降解的分子機理，并將有助于污染環境的生物修復。
本研究的denovo測序和轉錄組測序工作由
上海派森諾生物科技股份有限公司完成
文章索引：
Yunli Liu , et al. A Pseudomonas sp. strain uniquely degrades PAHs and heterocyclic derivatives via lateral dioxygenation pathways.Journal of Hazardous Materials (2020)
