2020-10-14
發表期刊：Molecular Therapy: Nucleic Acids
影響因子：7.032
● 文章題目：Identification of ncRNA-Mediated Functions of Nucleus-Localized miR-320 in Cardiomyocytes
● 技術手段：miRNA芯片，熒光原位雜交，RNA-seq，qRT-PCR，CRISPR/Cas9，chip-seq，RIP-seq，LC-MS，ChIRP（ChromatinIsolation by RNA Purification）
派森諾生物與華中科技大學同濟醫院攜手合作，于2020年在Frontiers in Microbiology上發表了ncRNA介導的心肌細胞核定位miR-320功能的鑒定，本研究中的RNA-seq，chip-seq和RIP-seq等工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
近年來，對microRNAs (miRNAs)亞細胞分布的系統分析表明，大多數miRNAs同時存在于細胞核和細胞質間。然而，核miRNA在心肌細胞中的完整功能目前尚不清楚。通過miRNA芯片技術，實驗揭示了大多數miRNAs在心肌細胞的核和細胞質部分都可以檢測到。作者通過前期實驗已經鑒定了miR-320、miR-30c和miR-21-3p在心血管疾病中的典型作用，這些miRNA也在細胞核中被檢測到，并通過原位雜交在正常人心臟樣本中確認了miR320在細胞質和細胞核中的表達，因此本研究以miR-320為例探索核定位miRNAs的功能。
核miR-320靶點的識別
核小RNA被認為是通過與基因啟動子結合來調控基因轉錄的。利用microPIR數據庫識別miR-320在細胞核中的潛在靶點，結合miR-320處理的H9c2心肌細胞的mRNA-seq分析結果，鑒定了12個有功能的基因(圖1A)。這些基因大部分在H9c2細胞中通過qRT-PCR成功驗證(圖1B)。
圖1 細胞核中miR-320靶點的識別
大部分啟動子結合位點在小鼠、大鼠和人類物種中均保守。通過CRISPR/Cas9方法產生Ago2敲除的AC16細胞(圖2A)，然后在Ago2敲低(kd)細胞中，重新表達攜帶核靶向信號肽(Ago2nls)的Ago2，Ago2nls轉位至細胞核(圖2B)，恢復mir -320介導的核靶基因調控(Cep57、Sorbs3、Mex3a、Fscn2、Ptgir和Vps37d)(圖2C)，這些數據為細胞核中Ago2/miR-320在轉錄控制中的直接作用提供了強有力的支持。
圖2 細胞核中Ago2/miR-320在轉錄控制中的作用
啟動子RNA可能參與Ago2-DNA結合
為了進一步研究DNA-Ago2/miRNA結合事件，作者在體內正常小鼠心臟上進行了Ago2-ChIP-seq。在部分基因的啟動子區域分別觀察到清晰的Ago2結合峰(圖3A)。而對于其他基因，結合峰不顯著(圖3B)。為了探究原因，通過轉錄組測序，觀察到Ago2靶向啟動子RNA的大量表達(圖3C)。相反，結合峰不顯著的基因很少、甚至檢測不到啟動子RNA的表達(圖3D)，但是Sorbs3例外，雖然與Ago2結合低，但是仍可以檢測到大量的啟動子RNA(圖3D)，啟動子RNA可能是必要的，但不足以讓Ago2與Sorbs3啟動結合。這些初步數據表明啟動子RNA可能參與Ago2 -啟動子結合事件。
圖3 Ago2-ChIP-seq 與RNA-seq
Ago2/miR-320工作模型
研究通過Ago2- chip -seq探索體外Ago2/miR-320啟動子的結合機制，檢測到miR-320 mimic處理增強了HL-1細胞中Ago2與Cep57、Fscn2、Mex3a和Ptgir啟動子的結合(圖4A)。為了確定Ago2/miR-320是靶向DNA還是靶向啟動子RNA，進行了RIP-seq來確定Ago2和基因啟動子RNA之間的關聯(圖4B-D)。這些數據表明，盡管啟動子RNA本身可能不是Ago2/miR-320的直接靶向，Ago2/miR-320結合在基因啟動子上是啟動子RNA依賴的。此外，通過ChIRP分析顯示，mir -320處理的心肌細胞中Cep57和Fscn2啟動子RNA在其啟動子DNA上的結合事件降低(圖4E)。根據這些數據，作者提出當沒有啟動子RNA時，miRNAs可能無法與DNA結合(圖4F)。如果啟動子RNA存在，則DNA啟動子可能不穩定，并可與miRNA結合(圖4G)。
通過液相色譜-質譜(LC-MS)測定細胞核中的Ago2/miR-320輔助因子，4個蛋白通過miR-320過表達可能與細胞核Ago2相關(圖4H)。在這些蛋白中，Ylpm1和Ssbp1是轉錄因子，它們可能共同參與Ago2/ mir -320介導的轉錄調控。
圖4 啟動子ncRNAs參與miR-320-DNA的結合
miR-320的激活/抑制作用可能取決于啟動子RNA
miR-320被預測靶向313個sense啟動子和300個antisense啟動子(圖5A)。然而，通過miR-320 mimic處理，沒有觀察到sense和antisense結合有顯著的激活或抑制差異 (圖5B)。在613個心肌細胞表達的miR-320靶基因中，有62個基因被miR-320顯著調控(圖5C)。數據表明，miR-320結合鏈(正義或反義)的選擇可能無法決定miR-320的激活或抑制作用。啟動子RNA如果是從下游基因的同一條DNA鏈轉錄而來，則被歸類為“sense”，對被miR-320顯著調控的檢測到啟動子RNA的48個基因進行分類(圖5D)，啟動子RNA大部分為antisense RNAs。
當檢測到antisense啟動子RNA時，miR320處理導致了12個基因的激活和14個基因的抑制。然而，當存在sense啟動子RNA時，7/8和12/14基因被miR-320下調(圖5E)。以Cep57和Fscn2為例，Cep57 sense啟動子RNA比其antisense啟動子RNA豐富，而Fscn2啟動子antisense啟動子RNA豐富(圖5G)。在功能上，Cep57的mRNA隨著Cep57啟動子RNA kd的升高而升高，而Fscn2的mRNA隨著Fscn2啟動子RNA kd的升高而降低(圖5H和5I)。miR-320作為Cep57和Fscn2的啟動子RNA特異性小干擾RNA (siRNA)，對Cep57和Fscn2 mRNA顯示了類似的作用(圖5H和5I)。
圖5 miR-320的激活/抑制作用可能取決于ncRNA
不同的啟動子RNA可能具有非常不同的調控模式。mir -320介導的基因激活(Cep57)或抑制(Fscn2)似乎依賴于啟動子RNA本身的功能特性(激活或抑制)(圖6)
圖6 核miR-320工作模型
結論
本研究基于Ago2- chip -seq、RIP-seq和全轉錄組seq數據的研究，帶來了以下一些見解:
1、miR-320介導的轉錄控制是核Ago2/miR-320依賴的；
2、Ylpm1和Ssbp1與核Ago2密切相關，可能共同參與了核miRNA介導的轉錄重構；
3、miR-320靶向的正義或反義啟動子的選擇可能不能決定其激活或抑制作用；
4、Ago2與啟動子DNA的結合似乎需要啟動子RNA的存在，但不一定直接與啟動子RNA結合；
5、對于sense啟動子RNA的基因，大部分被miR-320下調。對于antisense啟動子RNA，miR-320上調了一半基因，下調了一半基因；
6、具體來說，mir320介導的基因激活(Cep57)或抑制(Fscn2)似乎依賴于啟動子RNA本身的功能特性(激活或抑制)。
參考文獻：
Li H, Zhan J, Zhao Y, et al. Identification of ncRNA-Mediated Functions of Nucleus-Localized miR-320 in Cardiomyocytes. Mol Ther Nucleic Acids. 2020;19:132-143. doi:10.1016/j.omtn.2019.11.006
