2020-07-20
期刊：Clinical Infectious Diseases
影響因子：9.055
近日，派森諾生物與華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院陳煥春院士團(tuán)隊王湘如老師合作，在傳染病領(lǐng)域權(quán)威期刊Clinical Infectious Diseases在線發(fā)表了題為“A novel human acute encephalitis caused by pseudorabies virus variant strain”的研究論文。
研究背景
偽狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)屬于皰疹病毒(Alpha herpesvirinae)，宿主廣泛，豬是其天然宿主。被PRV感染的母豬表現(xiàn)出生殖衰竭，新生豬表現(xiàn)出致命性腦炎，死亡率100％，生長肥育的豬表現(xiàn)出呼吸窘迫和生長障礙，其他易感動物也通常以死亡告終。自1914年以來，根據(jù)臨床癥狀，動物接觸史或檢測到的抗體，偶有爭議的人類PRV感染病例。2017年以來，基于患者組織樣本的二代測序結(jié)果，中國又陸續(xù)報道了13例臨床診斷為人感染PRV的病例，但在上述所有病例報道中，均未成功分離出PRV。
在本研究中，報道了4例由偽狂犬病病毒（PRV）感染引起的人急性腦炎病例，總結(jié)了PRV感染人的臨床特征，并首次從患者腦脊液中分離得到一株P(guān)RV hSD-1/2019。此外，本研究還對該PRV分離株hSD-1/2019進(jìn)行了病因?qū)W和遺傳特征研究，該毒株的生物學(xué)特性表現(xiàn)與當(dāng)前我國豬群中流行的PRV變異毒株相似。該研究首次為PRV向人群的跨種傳播提供了直接有力的病毒分離證據(jù)。
研究材料和方法
臨床病例調(diào)查
獲得4例患者的血液、血清和腦脊液標(biāo)本，用于常規(guī)臨床和實驗室診斷。
病毒分離和病原學(xué)鑒定
采集患者腦脊液進(jìn)行病毒分離。通過PCR擴增PRV的gB和gE基因，透射電鏡(TEM)和間接免疫熒光檢測(IFA)確認(rèn)病毒的存在。
從感染細(xì)胞裂解液中提取hSD-1/2019和HuBXY/2018的基因組DNA，并利用二代BGI平臺和三代PacBio平臺進(jìn)行測序，由上海派森諾生物科技有限公司完成。收集NCBI中所有具有基因組序列的PRV菌株作為參考，基于基因組的完整編碼序列(CDS)區(qū)域和gC基因分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
進(jìn)行中和試驗以檢查PRV毒株的免疫原性。測定PRV菌株的斑塊大小，并在MDBK細(xì)胞中進(jìn)行比較。
研究hSD-1/2019和HuBXY/2018在小鼠和豬體內(nèi)的致病性。記錄每日直腸溫度和臨床體征，并使用gE特異性TaqMan qPCR檢測組織中的病毒。
倫理知情同意和參與
患者的所有治療均經(jīng)河南省人民醫(yī)院倫理委員會授權(quán)。
統(tǒng)計分析
數(shù)據(jù)以三種獨立檢測方法的均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(mean±SEM)表示。使用GraphPad Prism(version 6.0, La Jolla, CA, USA)進(jìn)行統(tǒng)計分析。
研究結(jié)果
4例人類急性腦炎診斷為PRV感染
在本研究中，研究團(tuán)隊總結(jié)了4例人類急性腦炎病例的流行病學(xué)和臨床特征。這4名患者的接觸史顯示，人類主要通過血液或粘膜接觸受感染的豬或受污染的物質(zhì)，具有顯著的感染風(fēng)險。患者在疑似傷口暴露后的7天內(nèi)出現(xiàn)“流感樣”的癥狀，病程發(fā)展較快，從最初的發(fā)燒發(fā)展為神經(jīng)系統(tǒng)癥狀（如癲癇發(fā)作）僅需1-5天。與病例1和病例4相比，合并呼吸衰竭的病例2和病例3出現(xiàn)更嚴(yán)重的肺炎，表現(xiàn)為多灶性散亂空域混濁、支氣管周圍實變?yōu)橹鲄^(qū)域和胸腔積液。
MRI顯示4例腦炎患者具有相似的腦部病變累及區(qū)域，其中病例1和病例3的視網(wǎng)膜MRI結(jié)果顯示分層效應(yīng)，提示視網(wǎng)膜脫離。與那些易感動物而不是豬的確切死亡結(jié)果不同，人類在感染后接受足夠的抗病毒治療可以存活，但一些患者會出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)后遺癥。
為了進(jìn)一步揭示PRV感染人的病例特征，研究人員以病例1為代表，通過動態(tài)監(jiān)測病毒gB拷貝數(shù)和PRV特異性抗體，展示其病因?qū)W和血清學(xué)變化。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)gB抗體的血清轉(zhuǎn)化時間明顯早于gE抗體，且在轉(zhuǎn)化后均持續(xù)保持陽性；血清中和抗體出現(xiàn)了超過4倍的滴度變化。ddPCR的結(jié)果顯示，在不同的取樣日期，在血液、腦脊液和咽喉拭子中均檢測到病毒DNA，在第8天到第15天在血液中檢測到高水平的病毒DNA，這與白細(xì)胞減少的持續(xù)時間相符，在第8天進(jìn)行抗病毒治療，有效地減少了血液中的病毒拷貝。值得注意的是，在晚期咽喉拭子中經(jīng)常檢測到大量的gB拷貝，提示咽喉可能是人類PRV復(fù)制和脫落的靶器官。
從患者中成功分離出PRV hSD-1/2019
研究人員首次成功從患者的腦脊液樣品中分離得到PRV毒株hSD-1/2019，并對其進(jìn)行了電鏡觀察、免疫熒光分析以及全基因組測序分析
系統(tǒng)發(fā)育分析
將組裝好的hSD-1/2019和HuBXY/2018 (GenBank 登錄號分別為MT468550和MT468549)基因組DNA進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。基于全基因組和gC基因的系統(tǒng)發(fā)育分析均表明該hSD-1/2019毒株屬于基因II型，來自中國的PRV分離株位于一個單獨的系統(tǒng)發(fā)育分支上，與其他國家的分離株不同。在該分支中，hSD-1/2019與PRV變異株HNX和HN1201相鄰，而與Fa、Ea和SC等菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
免疫原性分析
研究團(tuán)隊進(jìn)行交叉中和試驗以確定hSD-1/2019的免疫原性。結(jié)果顯hSD-1/2019與PRV變異株具有相似的免疫原性，但與毒株Ea不同。該研究測試了4名患者血清對hSD-1/2019和Ea的中和能力，所有患者的血清對hSD-1/2019的中和效價均高于對Ea的中和效價，進(jìn)一步支持了從免疫原性角度看，hSD-1/2019菌株可能導(dǎo)致人類感染。
hSD-1/2019體外增殖特性研究
通過空斑實驗、增殖曲線和CPE觀察，評價hSD-1/2019在多個細(xì)胞系中的增殖特性，這些觀察結(jié)果表明hSD-1/2019是PRV變異株，表現(xiàn)與PRV常規(guī)株不同。
hSD-1/2019的體內(nèi)致病性
研究團(tuán)隊通過在小鼠中檢測LD50來研究hSD-1/2019和其他PRV毒株的致病性。考慮到患者的接觸史，還在豬身上測試了其致病性。結(jié)果表明hSD-1/2019可感染小鼠和豬，并表現(xiàn)出較高的致病性。
討論
該研究較為系統(tǒng)地跟蹤研究并總結(jié)了人感染PRV導(dǎo)致急性腦炎的臨床病例特征，根據(jù)人源PRV株hSD-1/2019的病原學(xué)特征和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，首次分離并鑒定為中國變異株，為PRV的跨種感染研究提供了新的病原學(xué)證據(jù)和基礎(chǔ)。這種“威脅生命的新的人畜共患病”值得更多關(guān)注，人類PRV感染的機制需要進(jìn)一步研究。
據(jù)報道，PRV gD可結(jié)合人和豬具有相似親和力的nectin-1蛋白，啟動病毒進(jìn)入，這在很大程度上支持了PRV在人類感染的可能性。人類和動物之間沒有堅不可破的界限和物種隔離。例如，2003年的非典由果子貍攜帶SARS冠狀病毒感染人，還有發(fā)生在今年的新冠肺炎全球大流行。
近幾年發(fā)生的PRV感染事件也許正在警告我們這種跨物種傳播的可能性，無非是時間問題。病毒學(xué)家必須加強研究才能揭開病毒跨物種傳播的面紗！
本研究的denovo測序和部分?jǐn)?shù)據(jù)分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
派森諾生物可提供小基因組（細(xì)菌、真菌、細(xì)胞器、DNA/RNA病毒）測序服務(wù)，基于高通量測序技術(shù)，獲得基因組的圖譜信息，并在結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、比較基因組學(xué)層面通過差異分析、同源基因分析、共線性分析、物種進(jìn)化分析等手段探究小基因組的性質(zhì)，為溯源和進(jìn)化研究等提供證據(jù)。
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文章索引：
Qingyun Liu, Xiaojuan Wang, Xiangru Wang, et al. A novel human acute encephalitis caused by pseudorabies virus variant strain. Clinical Infectious Diseases, ciaa987.
原文鏈接：
https://academic.oup.com/cid/article-abstract/doi/10.1093/cid/ciaa987/5872012?redirectedFrom=fulltext
