2020-06-16
期刊：《Journal of Hazardous Materials》
影響因子：7.650
近日，派森諾生物與東北農業大學資源與環境學院攜手，在微生物基因組領域的《Journal of Hazardous Materials》發表研究成果！
研究背景
腈類是一類具有廣泛用途的劇毒化學藥品，這些化合物會對人類和生態系統構成潛在威脅。生物、物理、化學的方法可以用來消除腈類化合物，其中生物法因其溫和、經濟等特點，已被證明是一種較好的方法，受到了廣泛的關注。本研究的目的是探索能夠降解脂肪族腈的紫紅紅球菌BX2（Rhodococcus rhodochrous BX2）的生長特性、相關酶的生物學活性、基因組功能以及代謝途徑等，以期增進我們對脂肪族腈類化合物的認識，為紅球菌屬在生物修復和降解酶資源開發中的潛在應用提供新的前景。
研究材料和方法
圖1. 試驗設計
采用Illumina MiSeq和PacBio測序平臺，對BX2進行基因組特征和比較基因組學分析，了解并揭示BX2是如何有效地消除脂肪族腈并適應惡劣環境的。
研究結果
1、脂肪族腈的礦化
礦化作用是反映污染物完全降解的一個特別重要的指標，是潛在生物修復應用的基礎。本文以總有機碳(TOC)分析為基礎來評估有機物礦化作用效率，研究了BX2對脂肪族腈化生物礦化作用，腈化物的去除和碳化作用隨著時間變化的趨勢見圖2。BX2菌株的高礦化能力使其成為腈污染環境的實際生物修復的重要候選菌株。
圖2. 液體環境中脂肪腈的降解和礦化作用
2、BX2全基因組特性分析及適應腈污染環境分析
對BX2菌株進行高通量測序，拼接組裝得到1條染色體，3個質粒（圖3A）。基因組注釋分析發現，所有碳水化合物的中心代謝途徑(糖酵解、戊糖磷酸途徑和檸檬酸循環)均存在，在BX2基因組中，發現了編碼腈代謝的末端代謝物轉移到中樞代謝中的基因，表明BX2具有脂族腈降解和代謝的完整途徑。該結果為BX2礦化腈類化合物提供了遺傳基礎。
一般來說，氮源是受氮污染環境中豐富常見的化合物，被認為對微生物的生存至關重要。BX2擁有廣泛的編碼氮代謝相關蛋白的基因。在基因組中發現了特異性Amt型轉運蛋白(chr_orf02879)和谷氨酸脫氫酶(chr_orf02339等)或谷氨酰胺合成酶(chr_orf00120-chr_orf10021)-谷氨酸合成酶途徑(GS-GOGAT途徑)，這些基因參與了氨的同化。在營養元素缺乏和外來生物污染物豐富的氮污染環境中，BX2中轉運體系統的豐度可能對該生物的生存很重要。
水平基因轉移(HGT) 是不同于垂直基因轉移的遺傳物質的交流方式。在污染環境這一特異生態環境中，降解基因的水平轉移有著特殊的功能與作用。在轉座酶和整合酶的輔助下，BX2發生了許多水平基因轉移事件。對BX2進行預測后，發現其染色體以及質粒1、2、3含有的基因島個數分別是68、8、3和1個。這些基因島中所有已鑒定的基因包括輔助蛋白相關基因、苯甲酸酯等降解相關基因和各種轉錄調節因子。
圖3.（A）BX2基因組圈圖；（B）BX2基因組中預測到的基因島圖
3、在BX2中腈降解的遺傳基礎
從注釋結果來看，BX2具有很多腈分解代謝系統，這與該菌株幾乎只在脂肪族腈上有效生長一致。在BX2的質粒上發現了一個腈水合酶/酰胺酶基因簇和一個腈酶基因簇（圖4），腈水合酶/酰胺酶基因簇的大小為6114bp，由7個排列在一起的基因組成；腈酶基因簇的大小為2061bp，由2個基因排列在一起。在BX2中編碼腈降解的基因簇序列和組織是重要的信息，將有助于闡明腈降解基因的遺傳多樣性。
圖4.腈降解基因簇在BX2上的排列
4、比較基因組分析
圖5. (A)BX2基于16S rDNA序列的進化樹;(B)共線性分析
截至到2018年4月26日，紅球菌屬已測序的菌株有28個。28株分析菌株是從土壤、海水、病樹和污水處理廠等不同來源分離得到的，表明紅球菌菌株具有很高的抗病性，能夠適應多種自然環境。通過系統發育樹分析(圖5A)和共線分析(圖5B)，將菌株BX2劃分為玫瑰色紅球菌。在19個測序的菌株中發現了一個或多個質粒，菌株BX2有3個質粒。眾所周知，質粒在特定環境中生長是必不可少的，質粒攜帶著污染物降解、毒力、耐藥性等基因。結合全基因組測序結果表明， BX2可以更有效地降解丁腈化合物，并能適應多種生態環境。
5、腈降解酶的誘導性或組成性以及脂肪腈生物降解的主要途徑
圖6. (a-1)、(a-2)和(a-3)分別表示以乙腈、丙烯腈和丁腈為底物的腈降解酶的分布;
(a-4)表示脂肪族腈在胞內酶、細胞周質酶和胞外酶對脂肪族腈的降解
酶定位分析表明，負責降解脂肪族腈的酶主要存在于細胞中（圖6），且是可以被誘導產生的。為了進一步證實BX2中腈轉化酶的性質，我們考察了添加第二碳源(葡萄糖)對脂肪族腈的降解和細菌生長的影響。當脂肪族腈作為碳的唯一來源加入MS培養基時，這些化合物被高度降解（圖7a、b、c）。但當MS培養基中同時存在脂肪族腈和葡萄糖時，菌株BX2表現出明顯的生長特性，在初始階段不能降解脂肪族腈(這種現象稱為雙增長)，這可能是由于菌株表現出碳分解物抑制（CCR）造成的。結果證明適當濃度的葡萄糖可以誘導CCR，并且腈降解酶是可誘導的。
圖7.(a)、(b)和(c)分別表示在存在或不存在乙腈、丙烯腈和丁腈的情況下，添加不同濃度糖的MS培養基中菌株BX2的生長、腈的降解和葡萄糖的降解情況.
脂肪族腈降解的腈水合酶mRNA水平隨著時間增加而升高，在孵育6h、8h和36h時達到峰值，然后下降；酰胺酶mRNA水平表現出相似的趨勢（圖8）。隨著培養時間的延長，氮降解酶mRNA水平逐漸升高，分別在培養24h、36h和60h達到峰值，隨后下降。結果表明，外部碳源顯著提高了氮降解酶的mRNA水平，尤其是腈降解酶的mRNA水平。腈降解酶活性與mRNA在腈降解過程中的表達趨勢相似。結果表明，含葡萄糖的礦物培養基在細胞呈指數增長時表現出較強的CCR響應，使某些碳源優先被吸收，從而促進菌株BX2的生長和腈降解酶的表達。與此同時，介導CCR的分解代謝物控制蛋白CcpA在BX2菌株的基因組中被檢測到。
圖8. (a-1)、(b-1)、(c-1)分別表示三種腈類降解酶對乙腈、丙烯腈和丁腈降解的mRNA水平；
(a-2)、(b-2)、(c-2)表示三種腈類降解酶對乙腈、丙烯腈和丁腈(含葡萄糖)降解的mRNA水平；
(a-3)、(b-3)、(c-3)表示乙腈、丙烯腈和丁腈在BX2中降解腈的酶活性；
(a-4)、(b-4)、(c-4)表示乙腈、丙烯腈和丁腈(含葡萄糖)在BX2中降解腈的酶活性
前期研究中推測腈水合酶/酰胺酶和腈酶系統都參與了BX2中的脂肪族腈的降解，并且前者是主要的降解途徑。為了進一步驗證這一推斷，使用腈水合酶抑制劑和腈酶抑制劑進行實驗。如圖9可得，兩種抑制劑的添加對菌株BX2的細胞生長和脂肪族腈降解均有負面影響，并且腈水合酶抑制劑比腈酶抑制劑表現出更大的抑制作用。這些結果表明腈代謝酶都參與了腈的生物降解，其中腈水合酶/酰胺酶系統在脂肪族腈的降解過程中起著至關重要的作用。
圖9.不同酶抑制劑對細胞生長和腈降解的影響.
研究結論
1、BX2可以礦化三種脂肪類腈；
2、BX2基因組中發現與碳源和氮源代謝、脅迫感應與應答、信號轉導以及水平轉移相關的基因，基因組分析得到了兩個腈類降解相關的基因簇；
3、BX2中發現CcpA基因，該在碳代謝阻遏中起關鍵作用，其詳細功能仍需進一步研究。
4、腈降解酶誘導性的確定為腈的生物轉化奠定了基礎。
5、細胞內誘導的腈水合酶/酰胺酶和腈水解酶均參與了脂肪族腈的生物降解，而前者是重要途徑。
本文的研究有力地表明了菌株BX2在與腈類化合物相關環境污染的生物修復和降解酶資源開發方面的潛在應用。
本研究的denovo測序和部分數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
文章索引：An X, Cheng Y, Miao L, Chen X, Zang H, Li C. Characterization and genome functional analysis of an efficient nitrile-degrading bacterium, Rhodococcus rhodochrous BX2, to lay the foundation for potential bioaugmentation for remediation of nitrile-contaminated environments. J Hazard Mater. 2020;389:121906.
