2020-06-01
發表期刊：Environmental Pollution
影響因子：5.7
文章題目：Biochemical and genetic basis of cadmium biosorption by Enterobacter ludwigii LY6, isolated from industrial contaminated soil
技術手段：SEM、XRD、EDS、RNA-Seq
派森諾生物與四川農業科學院攜手合作，于2020年4月在《Environmental Pollution》上發表了細菌吸附鎘的生化及遺傳基礎相關研究。
我國部分耕地受到嚴重的重金屬污染，不僅造成蔬菜糧食減產，更威脅食品安全。鎘是目前嚴重的環境污染物之一，過量攝入鎘可影響人的泌尿系統、神經系統和骨骼發育，而目前臨床上尚無治療鎘中毒的有效藥物。
因此，國內外專家正在積極尋找有效的策略來控制重金屬污染向食物鏈的轉移。種種措施中，微生物吸附劑似乎是有前途的安全農業措施之一。已有研究證明，多種細菌可表現出良好的耐鎘能力，它們主要通過細胞外吸附和細胞內攝取來實現重金屬的生物穩定。
本研究從土壤中分離到一株耐鎘細菌——Enterobacter ludwigii LY6，首先對其進行鎘吸附效率評估，然后分析該細菌在不同鎘濃度處理下的形態變化和析出物組分，最后利用轉錄組學方法揭示LY6響應鎘脅迫的潛在分子機制。
1、 LY6菌株的分離和鑒定
該菌是從是從四川德陽什邡磷礦廠周邊土壤中分離得到的，基于基因測序結果和系統發育分析(圖1)，最終被鑒定為腸桿菌屬ludwigii LY6。
圖1 基于16S rRNA序列的LY6菌株系統發育分析
2、 鎘去除效率
在0 mg/L、1 mg/L、10 mg/L和100mg/L的鎘濃度下培養LY6，48h后測定液體培養基的pH值，采用石墨爐原子吸收光譜法測定細菌表面和內部液體介質中的鎘濃度。結果顯示，在1 mg/L和10 mg/L的鎘濃度下，LY6菌株的鎘去除率分別為39.3%和38.9%，而當鎘濃度提升至在100 mg/L時，LY6的鎘去除率明顯提高，達到56.0%（表1）。
表1 不同鎘濃度處理下LY6菌株的生長情況和鎘去除效率
3、 沉淀物分析
收集不同濃度鎘培養的菌株，用掃描電鏡觀察菌株的表面形貌。結果表明，在0 mg/L、1 mg/L和10 mg/L的鎘濃度下，菌株的表面形態無明顯變化。然而,在100 mg/L鎘培養時,細菌表面形成許多48-60納米大小的顆粒(圖2)。此時，細菌和納米顆粒表面在液體培養基中形成了黃色沉淀。進一步利用XRD和EDS對這些黃色沉淀分析發現，其化學成分為硫化鎘（圖3）。
圖2 不同濃度氯化鎘(mg/L)處理菌株LY6的掃描電鏡(SEM)形態學觀察
圖3 不同濃度氯化鎘培養LY6后收集沉淀物的元素組成分析
4、 轉錄組測序分析
從上述結論已知，大部分的氯化鎘可被LY6表面的胞外多糖吸收，但仍有部分鎘進入細胞，其必影響細菌的基因表達。因此對0 mg/L、1 mg/L和10 mg/L鎘濃度培養下的LY6進行轉錄組測序，并進行差異基因分析和功能富集分析。
4.1隨著鎘濃度增加而上調表達的基因
差異基因中，有106個基因的表達量隨鎘濃度的增加而增加(圖4)，其中包括多重耐藥蛋白marA和marR、氮同化調節蛋白nac、冷休克蛋白CspA、胸苷合成酶（thymidylate synthase）和滲透壓反應調節劑（osmolarity response regulator）。以marA為例，該基因被報道可激活DNA修復和脂質轉運所需基因的表達，從而增強腸道細菌的抗生素耐藥性。該分析結果說明以上基因在LY6對鎘脅迫的反應中發揮關鍵性的作用。
圖4 熱圖展示50個隨著鎘濃度增加而上調表達的基因
4.2、隨著鎘濃度增加而下調表達的基因
差異基因中，有73個基因的表達量隨鎘濃度的增加而降低（圖5）。與不含鎘的對照相比，鎘處理的樣品中，轉錄調節蛋白BolA、DnaK抑制蛋白、脫氧核糖體磷酸酶、多磷酸化轉移蛋白和硝酸還原酶相關的基因顯著下調。有趣的是，在鎘脅迫下，與能量代謝相關的基因：細胞色素o泛素氧化酶亞基3（cytochrome o ubiquinol oxidase subunit 3），也顯著下調。該基因可編碼細菌細胞的主要呼吸蛋白，其下調表達使細菌產生更少的活性氧(ROS)，從而保護細菌免受極端氧化損傷。
圖5 熱圖展示50個隨著鎘濃度增加而下調表達的基因
4.3、隨著鎘濃度增加，上下調規律發生變化的基因
差異基因中，11個基因，包括蛋白YpeC、伴侶蛋白ClpB和磷酸乙醇胺轉移酶ybiP，在低鎘濃度（1 mg/L）下顯著下調，但在較高的鎘濃度（≥10 mg/L）下，它們的表達水平較CK顯著升高(圖6)。相比之下，15個基因在低鎘濃度（1 mg/L）下顯著上調，而在高鎘濃度（≥10 mg/L）下顯著下調（圖6）。該結果提示不同濃度重金屬脅迫下，LY6可能具有不同的調控應對機制。
圖6 熱圖展示50個隨著鎘濃度增加，上下調規律發生變化的基因
4.4、功能富集分析
GO富集分析顯示（表2），當低鎘濃度（1 mg/L）處理時，差異基因的富集結果中沒有顯著的GO條目。當高鎘濃度處理（≥10 mg/L）時，分子功能中，差異基因多富集于“細胞色素c氧化酶活性”、“血紅素-銅末端氧化酶活性”、“氧化還原酶活性”條目；細胞組分中，差異基因多富集于“呼吸鏈”條目，生物過程中，差異基因多富集于“離子跨膜運輸”、“質子運輸”和“氫運輸”條目。說明氧化還原活性、呼吸鏈和轉運功能在LY6應對重金屬脅迫的響應中起重要作用。
表2 大于10 mg/L鎘濃度培養的LY6與對照組LY6的差異基因GO富集分析結果
KEGG富集分析顯示（表3），低鎘濃度（1mg/L）處理時，差異基因顯著富集于“果糖和甘露糖代謝”、“己內酰胺降解”、“檸檬烯和蒎烯降解”和“香葉醇降解”通路；而高鎘濃度（≥10 mg/L）處理時，差異基因顯著富集于與“煙酸和煙酰胺代謝”和“萜烯類中樞生物合成”相關的代謝途徑，以及與“細菌趨化”相關的細胞過程途徑。
表3 不同處理LY6的差異基因KEGG富集分析結果
本研究從磷礦廠周圍土壤分離得到一株耐鎘細菌——Enterobacter ludwigii LY6，它的鎘去除效率可達56%（100mg/L鎘處理下）。通過物理方法研究發現，LY6菌株可通過胞外多糖吸附鎘，并可在菌體表面生成硫化鎘納米顆粒。
轉錄組測序結果顯示，LY6在不同濃度下對重金屬脅迫具有不同的調控機制。氧化還原活性、呼吸鏈和轉運功能等GO功能，以及細菌趨化和萜烯類生物合成等KEGG通路與細菌的鎘耐受性和生物吸附密切相關。
本研究發現的耐鎘相關基因為耐鎘菌株的遺傳育種奠定了基礎。
本研究的測序和數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
