2020-05-13
發(fā)表期刊：International journal of molecular sciences
影響因子：4.183
文章題目：Effective MSTN Gene Knockout by AdV-Delivered CRISPR/Cas9 in Postnatal Chick Leg Muscle
技術(shù)手段：RNA-seq
派森諾生物與上海交通大學(xué)孟和教授課題組攜手合作，于2020年4月8日在《International journal of molecular sciences》上發(fā)表了通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法研究MSTN敲除對雞骨骼肌的影響的研究成果。
骨骼肌的生長發(fā)育與家禽的產(chǎn)量密切相關(guān)，了解雞肌肉生長發(fā)育的調(diào)控機(jī)制可以優(yōu)化肉的生產(chǎn)效率，已經(jīng)有研究確定了一些參與肌肉生長和發(fā)育調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因（例如MSTN，IGF1）。一些研究人員已經(jīng)獲得MSTN敲除(KO)山羊，并探索了這些山羊的轉(zhuǎn)錄組特征，以研究MSTN KO對肌肉的影響。在雞中利用MSTN基因編輯研究肌肉生長發(fā)育的分子機(jī)制的研究較少。CRISPR已經(jīng)在小鼠中被用于基因編輯以研究基因功能，但在雞肌肉中的應(yīng)用較少，雞的一種可行方法是產(chǎn)后基因編輯，這也可以探索基因功能和基因治療。為了驗證是否可以在雛雞的肌肉中完成產(chǎn)后基因編輯并確定轉(zhuǎn)錄組的變化，作者在雛雞中敲除了MSTN并對敲除的KO肌肉和WT肌肉進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。
CRISPR/Cas9，RNA-Seq
1、雛雞肌肉中MSTN的敲除(KO)
實驗首先設(shè)計了針對雞的MSTN外顯子1和外顯子3的單一向?qū)NA (sgRNA)序列，隨后使用腺病毒(AdV)載體共表達(dá)SpCas9和這對sgRNAs(圖1A)。圖1B顯示了利用CRISPR/ cas9介導(dǎo)的非同源末端連接(NHEJ)在雞基因組中產(chǎn)生5093 bp缺失，cDNA缺失728 bp，通過實驗驗證了AdV-CRISPR體系在雞細(xì)胞中MSTN基因的編輯功能。實驗將AdV-CRISPR轉(zhuǎn)入雛雞脛前肌，分別收集3日齡(3d)和14日齡(14d)雛雞的肌肉組織（圖1C）。實驗結(jié)果證實所有轉(zhuǎn)染AdV-CRISPR的肌肉均為缺失突變體，mRNA中缺失的核苷酸數(shù)量從736個到783個不等(圖1D)。
圖1敲除(KO) MSTN的肌肉的制備與驗證
2、KO肌肉中差異表達(dá)基因(DEGs)
本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序檢測KO肌肉和WT肌肉的mRNA表達(dá)譜。通過比較3d KO vs 3d WT和14d KO vs 14d WT，分析MSTN KO肌肉轉(zhuǎn)錄組的差異。與WT組相比，3d和14d 的KO組MSTN表達(dá)下調(diào)，14d時差異顯著(p-value < 0.001)(圖2C)。通路分析(IPA)顯示了在3d KO vs 3d WT中有14個與MSTN相互作用的因子，在14d KO vs 14d WT中有3個互作因子(圖2D)。 FMOD、MMP9、Tnf (家族)是與MSTN互作的常見分子。IPA顯示許多差異表達(dá)基因與骨骼肌組織發(fā)育相關(guān)。有5個差異表達(dá)基因，包括MMP9、EOMES和Ex-FABP，均在兩組比較中被發(fā)現(xiàn)。差異基因聚類顯示了這些與骨骼肌組織發(fā)育相關(guān)的基因的表達(dá)譜(圖2E,F)。
圖2 MSTN表達(dá)差異，差異基因火山圖和聚類熱圖
3、差異基因功能富集分析
根據(jù)獲得的DEGs，進(jìn)行GO富集分析和KEGG富集分析。GO富集的結(jié)果表明，在生物過程的前6個顯著富集GO項中，兩個比較組的差異基因顯著富集在細(xì)胞分化和增殖、肌肉生長和發(fā)育、能量代謝、凋亡過程、免疫系統(tǒng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo) (圖3A)。通過比對14d KO vs 14d WT的基因，實驗發(fā)現(xiàn)MSTN參與的GO terms，包括對胰島素受體信號通路的負(fù)調(diào)控，對凋亡過程的調(diào)控，以及對細(xì)胞因子活性的影響。
通過比較3d和14d的KO和WT骨骼肌，相關(guān)的分子和細(xì)胞功能包括：細(xì)胞發(fā)育，細(xì)胞生長和增殖，細(xì)胞功能和維持，細(xì)胞間信號和相互作用，以及細(xì)胞運(yùn)動。在3d KO vs 3d WT組和14d KO vs 14d WT兩個比較組共有的富集的15條通路中，與肌肉生長相關(guān)通路為：PDGF信號通路和STAT3信號通路。PDGF信號通路與快速生長和更大的肌肉質(zhì)量有關(guān)，而STAT3信號通路是成肌細(xì)胞增殖的關(guān)鍵介質(zhì)。PA分析發(fā)現(xiàn)了一個14d KO vs 14d WT組中的重要基因網(wǎng)絡(luò)，并涉及到MSTN。該網(wǎng)絡(luò)與骨骼和肌肉疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及機(jī)體損傷和異常有關(guān)(圖3B)。
圖 3 差異表達(dá)基因的GO富集和KEGG富集分析
本研究在所有KO肌肉中均實現(xiàn)了MSTN的大片段缺失（> 5 kb），以及在第14天，MSTN基因表達(dá)明顯下調(diào)。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示差異表達(dá)基因（DEGs）與細(xì)胞分化和增殖，肌肉生長和能量代謝有關(guān)。該方法為雛雞進(jìn)行產(chǎn)后基因編輯提供了一種潛在方法，本實驗結(jié)果也為進(jìn)一步研究肌肉生長發(fā)育的機(jī)制提供了基礎(chǔ)。
本研究的測序和數(shù)據(jù)分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
原文索引：
Xu K, Han CX, Zhou H, et al. (2020) Effective MSTN Gene Knockout by AdV-Delivered CRISPR/Cas9 in Postnatal Chick Leg Muscle. International journal of molecular sciences 21(7), 2584.
文章鏈接：
https://www.mdpi.com/1422-0067/21/7/2584
