2020-04-13
發表期刊：《Microbial Biotechnology》
影響因子：4.857
最近，《Microbial Biotechnology》上發表了一篇綜述文章，探討了高通量測序技術在蔬菜與水果表皮微生物組研究上取得的成果。
眾所周知，各種蔬菜水果，尤其是可以帶皮吃的，我們在食用之前通常都會洗洗再吃，不然這里面會有很多“臟東西”，吃完容易生病。那這些所謂的“臟東西”究竟是什么呢？泥土、農藥、污染物？當然不止，還有數量非常龐大，但我們肉眼卻看不見的微生物！就是這些體型極其微小的微生物，卻能給我們的生活帶來非常大的影響，接下來，小編給大家介紹下，這些存在于蔬菜水果表皮上，能讓人或植物生病的微生物。
在此之前，小編必須先給大家介紹這位讓我們有機會深入了解微生物群落的大功臣：DNA測序技術！在測序技術出現之前，我們只能基于菌群培養，根據菌群的宏觀形態或顯微鏡下的形態，做一些宏觀上的研究。
而隨著測序技術的發展，人們得以從核酸水平上研究微生物，獲得各種各樣的標記基因（遺傳標記），根據這些基因信息，便能基于PCR技術（比如傳統PCR、qPCR、多重PCR和基因芯片等）對微生物組進行檢測，極大的提高了食源性致病菌和植物病原體監測的準確性與便捷性。今天給大家介紹的這篇綜述，便詳細介紹了測序技術在果蔬表皮微生物組的研究上所取得的新進展。
1 、DNA測序技術與果蔬表皮微生物組的遺傳標記
1.1、食源性致病細菌
提到腸道疾病，我們首先想到的可能是食物中毒、腹瀉、嘔吐等常見疾病或癥狀，而水果蔬菜表皮上攜帶的致病細菌就會導致這類疾病的產生，比如大腸桿菌（Escherichia）、沙門氏菌（Salmonella）、葡萄球菌（Staphylococcus）、李斯特菌（Listeria）、志賀氏桿菌（Shigella）以及彎曲桿菌（Campylobacter）。
大腸桿菌屬主要包括三種病原菌：E. coli、E. albertii和E. fergusonii。其中，有的E. coli便會導致食物中毒，它通常存在于動物腸道中，可通過糞便釋放到環境中去，因此，E. coli的數量也可以反映蔬菜水果受糞便污染的程度。針對不同的大腸桿菌，目前我們可以通過16S rRNA基因測序和多重PCR進行鑒定與區分，詳見下表：
沙門氏菌屬主要包括的病原菌是腸球菌（S. enterica）和斑梭菌（S. bongori）。腸球菌又可分為6個亞種：enterica（I）、salamae（II）、arizonae（IIIa）、diarizonae（IIIb）、houtenae（IV）和indica（VI）。其中，enterica（I）便是引起食源性腹瀉的主要原因。目前主要使用多重PCR進行沙門氏菌的鑒定，詳情見下表：
李斯特菌屬包含了L. monocytogenes和L. seeligeri這兩種致病菌。其中L. monocytogenes（單核細胞增多性李斯特菌）是一種重要的食品源致病菌，能污染各種蔬菜水果，引起人李斯特菌病，目前可根據hly、iap、mpl、prfA、inlA、inlB、actA、plcA和16S RNA基因進行鑒定。
葡萄球菌屬主要與皮膚感染和食物中毒有關，比如S. aureus（金黃色葡萄球菌）就是一種與毒素型食物中毒有關的重要病原體。
志賀氏桿菌屬則能夠污染多種食物，并表現出不同的發病率和流行病學。比如S. dysenteriae（痢疾桿菌）會引起致死性流行病，S. flexneri會引起地方性傳染。有意思的是，與S. boydii相關的食源性疾病主要發生在發展中國家，而與S. sonnei相關的食源性疾病主要發生在發達國家。
彎曲桿菌屬的C. coli也是一種會表現出獨特流行病學特征的病原體。關于葡萄球菌屬、志賀氏桿菌屬、彎曲桿菌屬的鑒定，綜述原文中有詳細描述，感興趣的老師可以在原文中查看。
常見食源性致病細菌的基因組特征
1.2植物病原真菌
民以食為天，蔬菜水果等農產品毫無疑問與人類的生活息息相關，而植物病原真菌卻會導致植物病害，嚴重影響農產品價值。利用DNA測序技術，目前研究發現的植物病原真菌主要有：青霉菌屬（Penicillium）、鏈格孢屬（Alternaria）、曲霉菌屬（Aspergillus）、鐮刀菌屬（Fusarium）、炭疽菌屬（Colletotrichum）、鏈核盤菌屬（Monilinia）、葡萄孢屬（Botrytis）。
青霉菌屬與蔬菜水果采摘后腐爛有關，病原真菌主要有P. expansum、P. digitatum、P. griseofulvum、P. italicum和P. citrinum。其中，P. digitatum和P. italicum會引起柑桔類水果采后發霉。
不過，即使是病原菌，也有可利用之處。比如，P. chrysogenum可用于制作工業青霉素，P. expansum也被運用到棒曲霉素和橘霉素的生產中。在青霉菌屬的鑒定上，目前主要是用RAPD、SNP和微衛星分析來鑒定青霉菌屬的各種菌。同時，異環氧脫氫酶（IDH）基因可用于區分產青霉素和不產青霉素的青霉菌；patF、ITS 、Pepg1等基因可用于P. expansum的鑒定。
炭疽菌屬包含的病原菌主要有：C. gloeosporioides、C. acutatum（廣泛感染蔬菜水果）、C. coccodes和C. fructicola。其中，C. gloeosporioides會感染很多作物，使其患炭疽病。在炭疽菌屬的檢測上，可用的基因有：ITS、β-tubulin、actin、act、ApMat、cal、chs1、gapdh、gs、his3、tub2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和oxidase subunit1。
鏈格孢屬主要包含A. alternata、A. arborescens、A. brassicicola和A. solani這幾種病原菌。它們通常會引起植物病害和采后腐爛，有的甚至還能產生宿主特異性毒素（HSTs）。
曲霉菌屬包含的真菌種類很多。其中，病原菌有A. flavus、A. parasiticus、A. carbonarius、A. niger、A. tubingensis和A. westerdijkiae，它們會造成農作物腐爛，并產生黃曲霉毒素和赭曲霉毒素。其中，黃曲霉毒素的生物合成和調控基因（aflR、aflS、aflD、aflM、aflP、aflQ、aflO、aflQ）目前被廣泛用于產黃曲霉毒素物種的鑒定中。
鐮刀菌屬包含的致病真菌較多，包括F. oxysporum、F. fujikuroi、F. verticillioides和F. proliferatum，它們會在農作物和蔬菜中引起嚴重的疾病，并產生單端孢霉烯族真菌毒素。比如F. fujikuroi便能引起水稻惡苗病，并產生赤霉素（GAs）。
另外，鏈核盤菌屬真菌會導致水果和蔬菜表面出現褐斑（褐腐病），葡萄孢屬的真菌B. cinerea，則會在水果與蔬菜表面引起嚴重的灰霉病。原文中有對這些微生物詳細的介紹，感興趣的老師可以去原文中查看哦。
常見植物病原真菌的基因組特征
2 、果蔬表皮微生物群落的影響因素
目前，大量研究利用高通量測序技術，基于16S rRNA基因與ITS的序列特征，對果蔬表皮的細菌與真菌群落進行了研究。在本篇綜述中，作者在Science、NCBI、ScienceDirect和CNKI查閱并發現了64篇描述各種果蔬表皮菌群的研究，這些研究大多使用的是Illumina與Roche 454焦磷酸測序技術，主要可分為三類：
1、不同植物/基因型之間的微生物群落多樣性比較；
2、地理/環境因素和耕作方法對微生物群落的影響；
3、儲存和加工過程中，人工處理和質控過程對微生物群落的影響。
2.1、不同植物/基因型之間的微生物群落
目前已經有文獻報道不同水果和蔬菜葉片表面的細菌與真菌群落，如蘋果、藍莓、獼猴桃、菠菜、萵苣等。也有文章研究了不同植物組織的微生物群落，如果實、葉子、花和根。結果顯示，水果蔬菜表面的微生物群落與水果蔬菜本身的特征和生物過程有關。比如，不同葡萄品種上的細菌群落存在差異，而這些微生物群落的差異，可能會影響釀酒時的發酵效果。
此外，植物表面的微生物還可能與各種理化因子有關，最近的研究顯示，菠菜與芝麻菜表面的微生物群落與其葉片表面的礦物質存在聯系。植物根際的細菌群落或許也可用作土壤環境和礦物元素的檢測。這些研究結果表明微生物—宿主或微生物—礦物質之間的聯系非常廣泛。
2.2、地理/環境因素和耕作方法的影響
在地理/環境因素方面，研究顯示，許多環境因素均會影響微生物活動，包括溫度、濕度、光照、土壤有機質和礦物組成。近期，人們對葡萄酒質量、葡萄微生物群落和區域氣候之間的復雜關系進行了研究，結果顯示葡萄上的天然微生物群落對果實的成熟和葡萄酒的發酵，尤其是一些與葡萄酒顏色和風味有關的次級代謝物的產生，均起著重要的作用。
在耕作方面，農業投入和諸如化肥、殺蟲劑之類的耕作方法均會影響農產品上微生物群落的形成。比如，施肥便是影響玉米微生物群落的一個因素。有機農業和傳統農業的土壤與產品（如葡萄、蘋果、桃子、生菜和菠菜），有著不同的微生物群落。
2.3、儲存和加工過程中的影響因素
冷藏是保持食物新鮮和營養的常用方法。在冷藏過程中，微生物的組成和活性會發生變化，比如：
A、剛采摘的蘋果經過儲藏后，曲霉屬、葡萄孢屬、毛霉屬和青霉屬真菌的相對豐度會增加；
B、菠菜在4℃或10℃貯藏15天后，表面的細菌多樣性會下降；此外，對采摘后的果實進行物理或化學處理，也會影響其表面的微生物群落，比如：
a、伽馬射線照射會改變長葉萵苣表面的細菌群落，并降低病原菌的存活率和再生能力；
b、高靜水壓處理，會改變整個細菌種群的動態活動，使甜櫻桃和蘆筍的保質期得以延長；
c、抗生素和殺菌劑能通過改變微生物群落，延長某些蔬菜水果的貨架期；
d、次氯酸鹽處理能改變細菌群落的結構，延長胡蘿卜的保質期；
e、殺菌劑的應用改變了葡萄果實上酵母群落的動態變化。
總而言之，基于測序技術的水果蔬菜表面微生物群落研究，有利于提高蔬菜水果的采后貯藏質量。
DNA測序技術的發展為微生物組研究和遺傳分析提供了一種較好的方法和解決問題的手段，使微生物宏組學研究得到了很大的提升。遺傳研究為微生物在遺傳水平上的鑒定提供了DNA標記。這些標記廣泛用于PCR或基于芯片的檢測。在基于16S rRNA基因與ITS序列測序的基礎上，宏組學方法是研究蔬菜和水果表面復雜微生物群落的重要方法。蔬菜水果表面的微生物群落，不僅受到植物種類和基因型的影響，與地理環境因素、耕作方法和采后處理等都有密切聯系。由此可見，果蔬表皮微生物組研究，將從一個不同于傳統研究的視角，為我們農業、果蔬種植貯藏、人體健康和疾病防治等領域的發展，提供更多有價值的信息！
文章索引：
Shen YM, Nie JY, Kuang LX, et al. DNA sequencing, genomes and genetic markers of microbes on fruits and vegetables[J]. Microbial biotechnology, 2020.
點擊閱讀原文：
https://sfamjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/1751-7915.13560
