2020-03-27
發(fā)表期刊：Journal of Functional Foods
影響因子：3.197
文章題目：Indirectly stimulation of DCs by Ganoderma atrum polysaccharide in intestinal-like Caco-2/DCs co-culture model based on RNA-seq
技術(shù)手段：RNA-seq、qPCR、Elisa、western blot
派森諾生物與南昌大學(xué)攜手合作，于2020年2月在《Journal of Functional Foods》上發(fā)表了靈芝多糖對腸樣Caco-2/DCs共培養(yǎng)模型樹突狀細(xì)胞的間接刺激作用的研究成果。
靈芝多糖（PSG-1）是一種高純度的蛋白結(jié)合多糖，含有10.1%的蛋白質(zhì)和17種氨基酸，大量的研究表明PSG-1對多種免疫細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性有影響，直接接觸T淋巴細(xì)胞并刺激表面受體。然而，PSG-1作為一種大分子多糖，到達(dá)腸道后首先與腸上皮細(xì)胞（IECs）接觸，并不能直接刺激免疫細(xì)胞。樹突狀細(xì)胞（DC）作為有效的抗原呈遞細(xì)胞，具有強(qiáng)大的刺激初始免疫反應(yīng)的能力，成熟的DCs可以表達(dá)多種共刺激分子，同時合成和分泌腫瘤壞死因子（TNF）-α和白細(xì)胞介素（IL）-1等多種細(xì)胞因子，誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。近年來，許多研究表明，從食品和中藥中分離的天然多糖能夠誘導(dǎo)DCs成熟。為了更好地模擬腸道微環(huán)境，了解腸道上皮細(xì)胞與其內(nèi)部免疫細(xì)胞之間的相互作用，該研究建立了Caco-2/DCs共培養(yǎng)模型。利用RNA-seq對PSG-1刺激的DCs共培養(yǎng)模型中的所有轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行整體篩選，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了PSG-1對DCs免疫功能的影響及其可能的分子機(jī)制。
RNA-seq、qPCR、Elisa、western blot
1、利用illumina平臺對PSG-1刺激的DCs的所有轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行整體篩選。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了PSG-1組與對照組共有2293個差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因1180個，下調(diào)基因1113個如火山圖所示。PCA主成分分析和表達(dá)量熱圖可以看出PSG-1對樣本表達(dá)量的影響是非常明顯的。
圖1 mRNA表達(dá)譜和差異基因火山圖
2、根據(jù)獲得的DEGs，進(jìn)行GO富集分析和KEGG富集分析。GO富集的結(jié)果表明，在生物過程的前10個顯著富集GO項中，與免疫相關(guān)的GO項所占比例較大，如“免疫系統(tǒng)過程”、“防御反應(yīng)”和“免疫系統(tǒng)過程的正調(diào)控”，表明PSG-1在Caco-2/DCs共培養(yǎng)模型中仍對DCs的免疫功能產(chǎn)生影響。
圖2 差異表達(dá)基因的GO富集分析
3、通過對DEGs進(jìn)行KEGG信號途徑分析，共鑒定出109條顯著富集途徑。為了探討PSG-1在Caco-2/DCs共培養(yǎng)模型中是否能通過與Caco-2的直接接觸激活Caco-2與DCs之間的“對話”，最終影響樹突狀細(xì)胞的免疫功能。因此，與“環(huán)境信息處理”相關(guān)的顯著富集途徑中的3個途徑被進(jìn)一步研究：“細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用”、“NF-κB 信號通路”和“MAPK信號通路”。
圖3 顯著性前20個的KEGG富集途徑氣泡圖
圖4 NF-κB途徑的熱圖和KO圖
圖5 MAPK途徑的熱圖和KO圖
4、隨機(jī)選取15個與MAPK途徑和NF-κB途徑相關(guān)的DEGs，驗證RNA-seq結(jié)果，比較RT-qPCR和RNA-seq分別檢測的基因表達(dá)情況，從圖6中可以看出PSG-1間接作用后DCs的mRNA表達(dá)上調(diào)或下調(diào)趨勢一致。
圖6 qPCR驗證RNA-seq
5、采用ELISA法對DCs周圍培養(yǎng)液中典型細(xì)胞因子水平進(jìn)行了定量分析，來驗證PSG-1在翻譯水平上對DCs分泌細(xì)胞因子的影響。如圖7所示，PSG-1可促進(jìn)DCs細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10、RANTES、MIP-1α和MCP-1，除MCP-1外，上述細(xì)胞因子均呈劑量依賴性增加。上述細(xì)胞因子在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的升高說明PSG-1增加了腸樣Caco-2/DCs共培養(yǎng)模型DCs上炎癥介質(zhì)和趨化因子的表達(dá)，進(jìn)而影響其免疫功能。
圖7 DCs共培養(yǎng)模型中用PSG-1刺激產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子的水平
6、采用western blot法檢測了間接暴露于PSG-1（40、80和160μg/mL）24小時后DCs中與NF-κB途徑和MAPK途徑相關(guān)的關(guān)鍵蛋白的表達(dá)。如圖8所示，PSG-1顯著促進(jìn)腸內(nèi)Caco-2/DCs共培養(yǎng)模型中p-IκBα和p-p65的水平，表明PSG-1對NF-κB信號通路的激活是其對腸樣Caco-2/DCs共培養(yǎng)模型DCs免疫促進(jìn)作用的基礎(chǔ)。同樣，與對照組相比，ERK1/2、JNK和p38的磷酸化被激活，并且其作用呈劑量依賴性。說明PSG-1通過MAPK信號通路對DCs仍有穩(wěn)定的免疫促進(jìn)作用。
圖8 PSG-1間接刺激DCs的NF-κB和MAPK途徑關(guān)鍵蛋白質(zhì)的免疫印跡帶和相對強(qiáng)度
綜上所述，該研究利用RNA-seq進(jìn)行了DEGs、GO和KEGG分析，闡明PSG-1在腸樣Caco-2/DCs共培養(yǎng)模型中間接誘導(dǎo)DCs的免疫應(yīng)答和免疫功能，其中NF-κB和MAPK信號通路起重要作用。揭示了PSG-1可促進(jìn)DCs的成熟，調(diào)節(jié)DCs在腸道內(nèi)的免疫反應(yīng)，是誘導(dǎo)機(jī)體主動免疫、維持腸道穩(wěn)態(tài)、最終提高機(jī)體免疫力的關(guān)鍵。
本研究的測序和數(shù)據(jù)分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
原文索引：
Indirectly stimulation of DCs by Ganoderma atrum polysaccharide in intestinal-like Caco-2/DCs co-culture model based on RNA-seq.[J]. Journal of Functional Foods.2020,67.
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https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1756464620300748?via%3Dihub
