2019-12-27
最近，派森諾生物與新疆農業大學合作，在病毒學專業期刊《Archives of Virology》（影響因子：2.261）發表論文，利用宏病毒組測序技術，探究了新疆一馬術俱樂部中，良種母馬在持續體重下降后死亡的原因。研究發現了一種新型柯克病毒（Kirkovirus），并通過測序獲得了其全基因組信息。
2018年五月，新疆昌吉的一個馬術俱樂部中，發生了一起良種馬死亡事件，這是一匹2013年從美國引進的良種母馬，死亡時正好8歲。事實上，這匹馬在2016年懷孕，并產下小馬后，就出現了體重不斷下降的情況，最后于2018年五月死亡。在沒有更多病理學信息，只有糞便樣本的情況下，為了找出這匹馬死亡的原因，作者利用二代高通量測序技術，對糞便樣本中的病毒分布特征進行了研究。
①找出良種馬糞便中與其死亡有關的病毒；
②研究對應病毒的全基因組信息；
③調查中國主要產馬地區的馬體內的病毒組成譜。
研究與良種母馬死亡有關的病毒，并調查中國主要產馬地區的馬體內的病毒組成譜。
測序技術：Illumina HiSeq高通量測序平臺
測序模式：宏病毒組測序
實驗對象：良種母馬的糞便，與其產下的小馬駒的糞便
①收集良種母馬的糞便，與其產下的小馬駒的糞便；
②提取糞便樣本中的病毒RNA→反轉錄→隨機擴增，得到PCR產物；
③利用Illumina HiSeq高通量測序平臺進行測序和生物信息學分析；
④根據高通量測序得到的目標病毒序列深入研究，得到其全基因組信息，解析該病毒的基因特征；
⑤調查該病毒在中國主要產馬地區的馬體內的分布情況。
1. 母馬及其小馬駒糞便中的病毒
研究者從母馬及其小馬駒糞便的測序結果中，挑選了哺乳動物病毒的序列進行了深入分析，并從中發現了一種與Kirkovirus Equ1病毒的基因序列十分接近的病毒，且這個病毒僅在母馬糞便中存在，小馬駒的糞便中沒有！
而這個Kirkovirus Equ1（KirV Equ1）正好是一種對馬的健康狀態具有潛在威脅的病毒。KirV Equ1隸屬于擬科“Kirkoviridae”，首次發現于美國北部一匹患有特發性肝病的良種馬的肝和脾中，它和環病毒科（Circoviridae）的病毒一樣，有著一個環形的基因組，不過KirV Equ1的基因組更大，結構更復雜。因其對馬的潛在威脅，獸醫研究人員對其十分關注。
在本次測序結果中發現的這個與KirV Equ1十分相似的病毒，研究者根據其發現地點與死亡母馬的編號，將其暫時命名為“Kirkovirus Cj-7-7”。
2. Kirkovirus Cj-7-7的PCR檢測與全基因組圖譜構建
測序結果顯示，Cj-7-7與KirV Equ1的假定蛋白4基因序列的同源性高達90.17%。隨后，研作者以宏病毒組測序結果中拼接得到的Cj-7-7基因序列為模板，設計了針對假定蛋白4（413 nt）的PCR引物，并以小馬駒的糞便為陰性對照，對母馬的糞便樣本做了PCR檢測，結果顯示母馬的糞便中確實能檢測到413 nt的目的片段。
隨后，作者又以多種PCR引物對Cj-7-7進行擴增，并成功獲得了該病毒的整個基因組序列。此病毒的基因組序列全長3738 nt，比KirV Equ1少62 nt，序列相似度為86.7%。整個基因組包括一個開放閱讀框（nt 1-918），四個編碼假設蛋白的逆向閱讀框（nt 3608–3135，nt 3112–2576，nt 2553–1945和nt 1944–1354）。總體而言，Cj-7-7的全基因組圖譜與KirV Equ1相似。
圖1 Kirkovirus Cj-7-7（A）和KirV Equ1（B）的基因組圖譜
3. Kirkovirus Cj-7-7的系統發育分析
圖2為將Cj-7-7基因組序列與一些具有代表性的病毒序列進行比對后，建立的基于Rep蛋白基因的最大似然樹。系統發育分析表明，Cj-7-7菌株與Equ1親緣關系密切，與po-circo-like virus 21、22、41、51形成了與擬科Kirkoviridae相應，但與圓環病毒（circoviruses）和環狀病毒（cycloviruses）的譜系不同。
圖2 利用最大似然法構建的Rep蛋白的系統發育樹（黑圈的點為在本研究中發現的病毒）
4. Kirkovirus Cj-7-7的Rep蛋白基因與其它參考菌株的序列一致性
如表1所示，在KirV Cj-7-7中鑒定出的Rep基因與KirV Equ1的核苷酸序列相似度（91.5%）和氨基酸序列相似度（88.2%）最高，其次是4種po-circo-like病毒，核苷酸和氨基酸序列同源性分別為51.4-58.1%和37.2-46.9%。此外，KirV Cj-7-7的Rep基因與包括圓環病毒和環狀病毒在內的其余非近緣病毒核苷酸和氨基酸序列一致性均很低。
Kirkovirus Cj-7-7的Rep蛋白基因與其他參比菌株的序列一致性
5. Kirkovirus Cj-7-7的流行病學調查
流行病學調查顯示，來自同一馬術俱樂部的20匹良種馬的糞便樣本中，有12份在KirV Cj-7-7檢測中呈陽性反應，這表明，該病毒正在良種馬中傳播，不過，Cj-7-7基因在86匹良種馬的血清和91匹良種馬的鼻拭子中均未被PCR檢測到，這表明Cj-7-7對腸道細胞具有親和性。
研究者還在取自伊寧市30匹伊犁馬的7份糞便樣本、取自烏魯木齊市11匹亞洲野馬的2份糞便樣本中發現了KirV Cj-7-7。且PCR分析顯示陽性樣本的病毒之間沒有遺傳差異，這表明新疆北部健康的馬匹可能攜帶了Cj-7-7病毒。
本研究利用宏病毒組測序，在探究新疆一馬術俱樂部中，良種母馬在持續體重下降后死亡的原因的研究過程中，發現了一種新型柯克病毒（Kirkovirus），并通過測序獲得了其全基因組信息，且有以下發現：
①在死亡母馬糞便中發現的KirV Cj-7-7與Kirkovirus Equ1（KirV Equ1）密切相關，應該隸屬于Kirkoviridae擬科；
②Kirkoviruses具有多樣化的特征，且具有地域分布特征，健康馬匹可能攜帶該病毒。
本研究為中國主要產馬地區的馬體內KirV Cj-7-7的傳播提供了重要的分子證據。雖然目前的結果還不足以證明該病毒是導致母馬死亡的原因，但確實表明Kirkoviruses具有多樣化的特征且能在健康馬匹中檢出。
本研究的測序和數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
Xie J, Tong P, Zhang A, et al. First detection and genetic characterization of a novel kirkovirus from a dead thoroughbred mare in northern Xinjiang, China, in 2018[J]. Archives of Virology, 2019: 1-4.
https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs00705-019-04487-4
