2019-11-27
文章題目：
C-Src confers resistance to mitotic stress through inhibition DMAP1/Bub3 complex formation in pancreatic cancer
發(fā)表期刊：
Molecular Cancer
技術(shù)手段：
ChIP、WGBS、LC-MS/MS、表達(dá)譜等
派森諾生物與上海交通大學(xué)攜手合作，于2018年12月在《Molecular Cancer》上發(fā)表了有絲分裂應(yīng)激下胰腺癌細(xì)胞的生存相關(guān)機(jī)制的研究成果，影響因子10.679。
有絲分裂上的染色質(zhì)修飾與隨后的細(xì)胞周期中的轉(zhuǎn)錄激活密切相關(guān)。作者認(rèn)為該過程受致癌信號的調(diào)節(jié)，這將有助于胰腺癌的有絲分裂應(yīng)激抗性。本文中顯示DMAP1 / Bub3復(fù)合物介導(dǎo)有絲分裂應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而這種作用在胰腺癌細(xì)胞中被c-Src抵消。該研究旨在揭示在正常細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞之間對有絲分裂應(yīng)激不同反應(yīng)的潛在機(jī)制。
通過分子和細(xì)胞生物學(xué)方法確定Bub3和DMAP1在有絲分裂應(yīng)激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的相互作用。研究了c-Src對DMAP1 / Bub3介導(dǎo)的DNA甲基化和基因轉(zhuǎn)錄譜的抑制作用。分析了c-Src介導(dǎo)的DMAP1磷酸化與體內(nèi)紫杉醇活性和臨床病理特征之間的關(guān)系。
有絲分裂阻滯誘導(dǎo)Ser211處Bub3的p38依賴性磷酸化，從而促進(jìn)DMAP1 / Bub3相互作用。TAp73將DMAP1 / Bub3復(fù)合物募集到抗凋亡基因BCL2L1的啟動(dòng)子，從而介導(dǎo)DNA甲基化并抑制與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，DMAP1在Tyr 246處被c-Src在胰腺癌細(xì)胞中高度磷酸化，這阻礙了DMAP1 / Bub3相互作用和相關(guān)的細(xì)胞活化。阻斷DMAP1 pTyr-246可增強(qiáng)紫杉醇抑制的腫瘤生長。在臨床上，DMAP1 Tyr 246磷酸化與人類胰腺癌標(biāo)本中的c-Src活性和胰腺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。
1、在有絲分裂停滯期間，Bub3與DMAP1相互作用。
免疫沉淀和質(zhì)譜分析（圖1a，右圖）表明，有絲分裂阻滯極大地促進(jìn)了Bub3和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）相關(guān)蛋白DMAP1之間的相互作用。通過使用分別針對Bub3和DMAP1的抗體進(jìn)行共免疫沉淀分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了內(nèi)源性Bub3和有絲分裂阻滯下DMAP1之間的相互作用（圖1b）；雖然DNMT1缺失對DMAP1和Bub3之間的相互作用沒有影響，但DMAP1的消耗導(dǎo)致Bub3/DNMT1復(fù)合物的形成顯著減少（圖1c），表明DMAP1介導(dǎo)有絲分裂阻滯下Bub3-DNMT1復(fù)合物的形成。細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)表明有絲分裂停滯只導(dǎo)致了輕度的增加DMAP1/Bub3在癌細(xì)胞中的相互作用(圖1d)，推測某些癌癥特異性信號參與了調(diào)控Bub3/DMAP1復(fù)合物的形成；隨后證明在胰腺癌中高活性的c-Src在Bub3 / DMAP1相互作用中起負(fù)作用。通過構(gòu)建Bub3的一系列氨基酸截短圖，并在有絲分裂阻滯的HPDE細(xì)胞中進(jìn)行的免疫共沉淀分析，確定了與DMAP1結(jié)合區(qū)范圍（圖1f）。
圖1 在有絲分裂停滯期間，Bub3與DMAP1相互作用
2、 p38在Ser211磷酸化Bub3并促進(jìn)Bub3/DMAP1相互作用。
Bub3 / DMAP1相互作用是磷酸化依賴性的，有絲分裂阻滯誘導(dǎo)的Bub3 / DMAP1相互作用被SB203580（p38抑制劑）處理特異性破壞（圖2b）。一致的是，用SB203580進(jìn)行的預(yù)處理在具有c-Src抑制作用的情況下很大程度上阻斷了細(xì)胞中有絲分裂阻滯誘導(dǎo)的Bub3 / DMAP1相互作用（圖2c）。這些結(jié)果表明p38活性是Bub3 / DMAP1相互作用所必需的。免疫共沉淀分析也表明，有絲分裂阻滯促進(jìn)了兩種細(xì)胞（圖2d）中p38與Bub3的結(jié)合。體外蛋白質(zhì)磷酸化分析和Scansite分析預(yù)測了Bub3的氨基酸序列中兩個(gè)潛在的p38磷酸化殘基。掃描位點(diǎn)分析 (圖2f，左側(cè))和進(jìn)一步的體外蛋白磷酸化分析表明，只有進(jìn)化上保守的Ser 211突變?yōu)楸彼幔拍芟齪38介導(dǎo)的Bub3磷酸化，這一點(diǎn)在使用特定的Bub3 Ser-211抗體的放射自成像和免疫印跡分析中得到了證實(shí)。GST拉檢結(jié)果表明，p38介導(dǎo)的Bub3 S211磷酸化足以使其與DMAP1結(jié)合（(圖2g），在有絲分裂脅迫下，p38介導(dǎo)的Bub3 S211磷酸化是其與DMAP1結(jié)合所必需的。
圖2 p38在Ser211位點(diǎn)磷酸化Bub3并促進(jìn)Bub3/ dmap1相互作用
3、C-Src使Tyr246處的DMAP1磷酸化并破壞Bub3 / DMAP1復(fù)合物的形成。
c-Src在整個(gè)細(xì)胞周期中始終與DMAP1相關(guān)，而與Bub3無關(guān)，且通過Scansite分析，在DMAP1氨基酸序列上發(fā)現(xiàn)了許多潛在的Src磷酸化位點(diǎn)；進(jìn)化上保守的Tyr 246突變?yōu)楸奖彼岬耐蛔兿薙rc介導(dǎo)的DMAP1磷酸化（圖3a，b）。c-Src介導(dǎo)的DMAP1磷酸化阻礙了Bub3 / DMAP1的相互作用。GST拉檢數(shù)據(jù)（圖3d，e）表明c-Src使DMAP1磷酸化不會直接中斷Bub3 / DMAP1的相互作用，并且還有另一個(gè)未鑒定的成分，例如含有SH2結(jié)構(gòu)域的分子，可以與Bub3競爭，在有絲分裂停滯下與酪氨酸磷酸化的DMAP1相互作用。
圖3 c-Src磷酸化Tyr246處的DMAP1，干擾Bub3/DMAP1復(fù)合物的形成
4、C-Src使DMAP1磷酸化并阻止Bub3 / DMAP1抑制的抗凋亡基因轉(zhuǎn)錄。
為了研究c-Src介導(dǎo)的DMAP1磷酸化對Bub3 / DMAP1相互作用的抑制作用是否參與有絲分裂后基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，作者耗竭了SW1990細(xì)胞中的內(nèi)源DMAP1，并重建了RNAi的WT rDMAP1或DMAP1 rY246F的表達(dá)。通過cDNA微陣列分析檢查了全局基因表達(dá)譜，在表達(dá)DMAP1 rY246F的細(xì)胞中顯示較低水平的許多轉(zhuǎn)錄物富含與抗凋亡，炎癥和自噬有關(guān)的基因，而在表達(dá)DMAP1 rY246F的細(xì)胞中顯示較高水平的轉(zhuǎn)錄物與促凋亡或存活維持相關(guān)（圖4b），并認(rèn)為被DMAP1 Y246F表達(dá)下調(diào)的基因是Bub3 / DMAP1復(fù)合體的潛在靶標(biāo)。而Bub3 S211A的表達(dá)顯著逆轉(zhuǎn)了DMAP1 Y246F抑制的基因轉(zhuǎn)錄，同時(shí)發(fā)現(xiàn)DNMT1消耗消除了DMAP1 Y246F對基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用（圖4c，d）。以上結(jié)果結(jié)合膜聯(lián)蛋白V試驗(yàn)，表明在有絲分裂脅迫下，Bub3 / DMAP1復(fù)合物可作為抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄抑制因子，其作用在具有高水平DMAP1 pY246的腫瘤細(xì)胞中受損。
圖4 Bub3/DMAP1復(fù)合物抑制抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄
5、C-Src介導(dǎo)的DMAP1磷酸化阻止Bub3 / DMAP1介導(dǎo)的DNA甲基化。
已知DMAP1/DNMT1與哺乳動(dòng)物的甲基化有關(guān)，為了知道DMAP1 pY246在基因轉(zhuǎn)錄中的抑制作用與其對DNA甲基化的潛在作用有關(guān)，作者對WT rDMAP1，DMAP1 rY246F或DMAP1 rY246F加rBub3 S211A的重組表達(dá)的SW1990細(xì)胞進(jìn)行了WGBS分析。結(jié)果表明，DMAP1 rY246F表達(dá)增強(qiáng)了富含CpG和缺乏CpG的啟動(dòng)子的DNA甲基化（圖5a，左圖）。與其他組相比，具有DMAP1 rY246F表達(dá)的細(xì)胞組在富含CpG島以及CpG島的海岸上導(dǎo)致了高甲基化的模式（圖5a，右圖）。與WT rDMAP1相比，在具有rDMAP1Y246F表達(dá)的SW1990細(xì)胞的啟動(dòng)子下游區(qū)域檢測到了CG甲基化的顯著升高，這被rBub3 S211A的伴隨表達(dá)顯著逆轉(zhuǎn)（圖5b）。總的來說，這些結(jié)果表明DMAP1 pY246在基因組的整體DNA甲基化中起負(fù)作用，而DMAP1-Bub3復(fù)合物的形成是特定基因DNA甲基化所必需的。Bub3與有絲分裂阻滯期間的轉(zhuǎn)錄因子TAp73相關(guān)，TAp73耗竭逆轉(zhuǎn)了用DMAP1 Y246F表達(dá)的SW1990細(xì)胞中的BCL2L1轉(zhuǎn)錄，序列分析和ChIP分析表明TAp73在覆蓋有絲分裂結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子區(qū)域富集（圖5e）。此外，還發(fā)現(xiàn)在SW1990細(xì)胞的有絲分裂停滯下，BCL2L1啟動(dòng)子相關(guān)的Bub3，Bub3 S211磷酸化（圖5f）也顯著增加。這些數(shù)據(jù)表明，TAp73負(fù)責(zé)啟動(dòng)子中Bub3和DMAP1復(fù)合物的積累，其中Bub3 S211磷酸化對于DMAP1 / DNMT1募集是必不可少的。
圖5 c- src介導(dǎo)的DMAP1磷酸化可阻斷DMAP1介導(dǎo)的DNA甲基化
6、DMAP1 Y246磷酸化可抵消紫杉醇的體內(nèi)抗腫瘤活性。
c-Src介導(dǎo)的DMAP1 Y246磷酸化通過抑制有絲分裂阻滯下的Bub3 / DMAP1相互作用來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活（圖4e），接下來作者通過動(dòng)物模型確定其在腫瘤發(fā)生中的意義。裸鼠實(shí)驗(yàn)表明，具有WT rDMAP1表達(dá)的腫瘤細(xì)胞仍然能夠通過紫杉醇治療引起快速的腫瘤發(fā)生（圖6a和b）。相反，rDMAP1 Y246F的表達(dá)很大程度上抑制了腫瘤的生長。但是，rDMAP1 Y246F的抑制作用被rBub3 S211A的共表達(dá)所阻斷。這些數(shù)據(jù)表明DMAP1 Y246磷酸化對Bub3 / DMAP1相互作用的抑制作用促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展。為了進(jìn)一步確定該發(fā)現(xiàn)的臨床意義，作者通過免疫印跡和IHC分析了人類胰腺腫瘤標(biāo)本中DMAP1 pY246的水平，并通過DMAP1 Y246磷酸化水平的高和低評估了患者的生存時(shí)間（圖6e），發(fā)現(xiàn)那些具有高DMAP1 pY246水平的腫瘤（61例）的中位生存期顯著降低，揭示了DMAP1 Y246磷酸化與人類胰腺癌患者預(yù)后不良之間的緊密關(guān)系。
圖6 腫瘤發(fā)生需要DMAP1 Y246磷酸化
結(jié)論
作者的發(fā)現(xiàn)表明，Bub3 / DMAP1復(fù)合物對于有絲分裂阻滯后的響應(yīng)基因表達(dá)至關(guān)重要，并證明在有絲分裂應(yīng)激下癌細(xì)胞的生存優(yōu)勢依賴于c-Src對Bub3 / DMAP1介導(dǎo)的凋亡的抑制作用。有絲分裂停止后，Bub3在基因激活中的新作用得到了確認(rèn)，這為我們提供了一種新的視角，以了解表觀遺傳修飾因子是如何根據(jù)環(huán)境信號不斷調(diào)節(jié)的。另外，c-Src對Bub3/DMAP1/DNMT1軸的抑制作用闡明了癌細(xì)胞抵抗有絲分裂應(yīng)激的關(guān)鍵途徑，這一發(fā)現(xiàn)為提高c-Src活性上調(diào)的抗有絲分裂治療的胰腺癌的治療水平提供了重要的分子基礎(chǔ)。
本研究的WGBS測序和數(shù)據(jù)分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
原文索引：
Li, J., Hu, B., Wang, T., Huang, W., Ma, C., Zhao, Q., … Jiang, Y. (2018). C-Src confers resistance to mitotic stress through inhibition DMAP1/Bub3 complex formation in pancreatic cancer. Molecular Cancer, 17(1).doi:10.1186/s12943-018-0919-5
