2018-04-26
派森諾生物與中科院水生生物研究所攜手合作，通過 Illumina NextSeq500高通量測序平臺，應用轉錄組測序方法，對草魚呼腸孤病毒進行了基因轉錄水平的研究，對GCRV感染的草魚腎（CIK）細胞轉錄水平的變化進行了分析，揭示了GCRV感染的機制。作者陳庚和通訊作者汪亞平關于GCRV轉錄組測序的研究成果《Transcriptomics Sequencing Provides Insights into Understanding the Mechanism of Grass Carp Reovirus Infection》于2018年2月6日發表在《International Journal of Molecular Sciences》上。
草魚（Ctenopharyngodon idellus）是中國重要的水產養殖魚類，2015年草魚產量達到580萬噸，占世界淡水養殖產量的13％以上。草魚呼腸孤病毒（GCRV）可以引起草魚的出血性疾病，該疾病是對草魚具破壞性的疾病之一，會造成草魚養殖業巨大的經濟損失。近來，對GCRV的研究主要集中在鑒定參與GCRV感染免疫應答的基因，GCRV編碼蛋白的克隆和鑒定，GCRV疫苗的開發等方面，對于GCRV侵襲和感染的機制仍有待闡明。
GCRV感染誘導細胞病變效應
模擬感染和病毒感染的細胞變化圖
在模擬感染的細胞中未觀察到細胞病變效應（CPE）。然而，在感染GCRV的細胞中，感染后8小時觀察到CPE，并隨著時間的推移變得更明顯。感染后72小時，可以看到大部分細胞壞死.
CCK-8 kit細胞活力試驗
細胞活力試驗結果圖
模擬感染細胞顯示接近100％的生存力，而感染8, 24和72小時的細胞，僅觀察到74.66％，56.88％和36.95％的細胞活力。因此，結果提示GCRV的感染是有效的。
轉錄組序列數據初步分析
PCA分析結果
對測序數據的整理可以看出，對于所有文庫，Q20≥96％，Q30≥92％，比對百分比≥87％。這些結果表明了測序數據的高質量。根據表達水平對每個樣品進行的主成分分析（PCA）結果表明模擬感染細胞明顯不同于感染GCRV的細胞。此外，對于感染GCRV的樣品的相關值與感染后時間成正比; 8小時的樣本與24小時和72小時的樣本不一致。
表達差異基因（DEG）鑒定
將GCRV感染過程分為三個階段：早期（感染后0-8小時），中間（感染后8-24小時）和晚期（24-72小時）階段。在每個階段，將來自后一時間點的數據與前者進行比較（8與0, 24與8和72與24對比）以鑒定差異表達的基因（DEG）。
GO和KEGG富集分析
上表中列出了感染后三個階段中富集的前五個GO Term信息。GO富集分析結果表明，感染的早期階段主要與鐵運輸，碳水化合物代謝和包涵體有關。在感染的中期，鐵離子結合，溶酶體類顯著富集。同時，后期階段主要與代謝過程有關，如脂質生物合成，類固醇代謝和酒精生物合成代謝。
上表展示了三個階段中富集的前五個KEGG pathway信息。KEGG富集分析的結果則表明，在感染早期，DEGs主要涉及與局灶粘附，ECM（細胞外基質）-受體相互作用，細胞因子-細胞因子受體相互作用有關的途徑。在中期，與病毒進入細胞和細胞識別有關的途徑被富集，包括吞噬體，溶酶體和hippo信號通路。在感染后期，顯著富集的途徑是類固醇和類萜骨架的生物合成，以及酮體的降解。
在關鍵KEGG pathway中表達的DEG
選定的KEGG通路中DEGs的表達模式線圖
進一步評估ECM-受體相互作用，局灶粘附，吞噬體和溶酶相關的關鍵KEGG pathway中DEGs的表達模式，對感染后每個時間點四種KEGG途徑進行比較，結果顯示，這些DEGs的表達模式存在顯著差異。具體來看，與ECM-受體相互作用和局灶粘附相關的DEGs，如col5a1，itgb7和sptbn5在感染早期階段上調，但在中期和晚期階段下調。相反，參與吞噬體和溶酶體的DEGs的表達，如itgb2，srb1，和sel1呈現相反的趨勢，在感染早期下調，但在中后期上調。
三個感染階段關鍵DEG的鑒定
關鍵的DEGs可能在對環境變化的應對中發揮重要作用，因此會對它們進行識別和注釋。分析的結果顯示，感染后0至8h之間的大多數上調基因（例如ptpε，itga7和ppl）與細胞信號傳導相關，而諸如cxcl10和ifi271的下調基因則與免疫相關。8至24 h間上調的基因包括viperin，tap1，tlr3和irf11。同時，下調的基因如angptl2，pgp和rap1gap1，主要與血管有關，這也可能解釋了為什么草魚在GCRV感染后會出現出血癥狀。其他下調基因包括蛋白質損傷修復相關基因，如mical3b和hspb11。最后，在24和72h之間，上調基因主要與程序性細胞死亡，細胞凋亡和炎癥相關，與在24和72h觀察到的較高的細胞活力降低結果一致。 此階段的下調基因主要參與類固醇合成，而另一些則與微管和血管有關。
關鍵干擾素相關基因的表達模式
涉及免疫應答的關鍵基因的表達模式
本研究檢測了關鍵的干擾素相關基因的表達模式。結果表明，除基因mx-1外，大多數基因在感染后24或72h顯示為log2倍數變化≥2甚至≥10，而在感染后8h表達水平下降。這些結果說明了GCRV感染誘導的強免疫應答。
選定的DEG的 RT-qPCR驗證
RT-qPCR驗證轉錄組測序數據
為了證實RNA-Seq數據的可靠性，選擇了參與吞噬體途徑的8個基因進行RT-qPCR分析。驗證的結果表明，通過qPCR獲得的所有8個DEG的表達模式與來自RNA-Seq分析的表達模式相似，盡管相對表達水平不完全一致。 因此，RT-qPCR分析的結果證實了RNA-Seq數據的可靠性和準確性。
結論：
研究表明，在感染早期，GCRV與多糖相互作用并積聚在細胞表面，然后與GCRV受體結合啟動由整聯蛋白介導的內吞作用。在感染的中期，GCRV很可能受v-SNARE蛋白的調控并從內體區運輸至溶酶體。在階段，GCRV通過幾種不同途徑影響細胞膜中類固醇的結構，然后在階段導致細胞死亡。這些發現拓寬了現有的對GCRV入侵的認識，并可能對制定針對GCRV的疾病戰略有幫助。
原文索引：Chen G, He L, Luo L, et al. Transcriptomics Sequencing Provides Insights into Understanding the Mechanism of Grass Carp Reovirus Infection.[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2018, 19(2):488.
