2019-08-01
文案｜微生物組產品線
正 文
近期，派森諾生物與中國科學院合作，在《Science of the Total Environment》（影響因子5.589）發表論文。本研究基于DNA層面的16S rRNA基因和RNA層面的16S rRNA的高通量測序，分別探究了水稻根際土總微生物組和活性微生物組的群落特征，展現根際效應對根際土壤微生物組的重要影響。
研究背景
根際微生物組對植物的生長和健康有著至關重要的作用，被認為是植物第二基因組的一部分。根際微生物通過影響反硝化、硝化和呼吸等根際生物進程來調節生物地球化學循環。以水稻土為例，潛在的鐵還原劑（如Geobacter 和Anaeromyxobacter）在根際顯著富集，表明根際微生物對土壤鐵循環有著重要影響。根際有益微生物通過加強植物對水分和營養的攝取、減少過多重金屬攝入、誘導植物對病原菌產生抗性等促進植物健康生長。
根際微生物在土壤中有四個生理階段：活躍期、潛在活躍期、休眠期和死亡期。活性微生物只占所有微生物的一小部分，它們直接參與生物地球化學循環，因此活性微生物的研究將為土壤功能微生物研究提供更為準確的信息。通過比較活性菌和總微生物群落結構的差異能夠更好地理解微生物對環境變化的響應。
根際微生物群落結構在不同植物基因型、植物種類、土壤類型和植物的生長階段有著顯著的差異。水稻淹水后的土壤含氧量有限，但由于水稻根系釋放氧氣，使其根際相對于非根際土壤是一個含氧區，這就造成了從根表面到非根際土壤持續的氧化還原和養分梯度。根系分泌物的豐度和多樣性取決于植物的生長發育階段，因為它能夠影響土壤的氧化還原和養分梯度，進而影響土壤微生物群落。
得益于下一代高通量測序，很多研究報道了根際土壤微生物的群落組成和結構，但土壤活性微生物組和總微生物組相結合的研究較少，因此本研究結合DNA層面的16S rRNA基因和RNA層面的16S rRNA高通量測序，以比較水稻土活性細菌和總細菌群落結構的差異。
研究目的
? 探究水稻不同的生長階段和土壤區域對土壤細菌群落的影響；
? 比較水稻土活性細菌和總細菌群落結構的差異。
研究方法
測序技術：Illumina MiSeq高通量測序平臺
測序模式：細菌16S rRNA 基因V4V5區+16S rRNA V4V5區
實驗對象：水稻不同生長時期的根際土和非根際土
實驗設計
研究結果
土壤和孔隙水化學性質
銨離子（NH4+soil）濃度和pH水平在根際土中顯著低于非根際土，而亞硝酸鹽和硝酸鹽（NOx-soil）濃度在根際土中顯著高于非根際土。低分子量有機酸（LMWOAs）和總有機碳（TOCsoil）在水稻的不同生長階段有著不一樣的含量，并且在根際土中高于非根際土。孔隙水（pw）中的NH4+pw、NOx-pw、TOCpw和TNpw（總氮）濃度隨著水稻的生長發育而減少，并且NH4+pw在根際土的下降速度比非根際土的下降速度更快，而TOCpw和NOx-pw含量在根際土中高于非根際土。與總細菌群落相比，活性菌群落有著更為明顯的多樣性變化。
基于DNA和RNA水平測定的根際土細菌群落結構
實驗一共包含29098個OTUs，共29,906,509條序列，其中包括293個古菌OTUs共151,884條序列。在根際土中，基于RNA水平的群落Chao1指數范圍為成熟期的4628到幼苗期的5653，基于DNA水平的群落Chao1指數范圍為幼苗期的4663到成熟期的6739（表1）。表1顯示測序的覆蓋率為95.6%-97.9%，表明土壤中的大部分細菌類群已被覆蓋。基于16S rRNA基因的細菌多樣性在不同生長階段和土壤間的變化不明顯，而基于16S rRNA的細菌多樣性在不同土壤間變化顯著。
表1：基于16S rRNA和16S rRNA基因測序的細菌群落結構參數
基于16S rRNA測序的細菌群落共有65個優勢OTUs以及3752-5698個稀有OTU，基于16S rRNA基因測序的細菌群落共有57個優勢OTUs以及3005-4856個稀有OTU，兩者共同擁有38個優勢OTUs。基于總OTUs（圖1a）、優勢OTUs（圖1b）和稀有OTUs（圖1c）的總細菌群落結構和活性細菌群落結構有著顯著差異。基于DNA水平和RNA水平檢測到的細菌群落在門水平（圖2a）和目水平（圖2b）相互分離。一共有98個細菌類群的相對豐度在RNA和DNA檢測水平之間有著顯著差異。Euryarchaeota、Saprospirae、Bacilli、Plancyomycetes、OD1 group、β-Proteobacteria 和Mollicutes在DNA檢測水平的相對豐度更高，而Acidobacteria、Cyanobacteria、Elusimicrobia、Fibrobacteres、Clostridia、α-Proteobacteria、δ-Proteobacteria、γ-Proteobacteria、Rhodocydales 和Verrucomicrobia在RNA檢測水平的相對豐度更高（圖3）。一些目水平微生物，在活性細菌群落中占有很大的比例，但在總細菌群落中豐度卻很低。例如，Rhodospirillales、Methylococcales、Spirochaetales 和Myxococcales 在活性細菌群落中的相對豐度大于2%，但它們在總細菌群落中的平均相對豐度不到0.8%（圖2b）。
圖1：基于Bray-Curtis距離的微生物群落結構PCoA分析
圖2：基于門水平（a）和目水平（b）的細菌組成聚類分析
圖3 樣本間細菌類群相對豐度熱圖
活性細菌群落組成在水稻不同生長時期都比較穩定，但在根際和非根際土之間有著顯著差異（圖1a，b，c）。在總細菌群落中，只有屬于Bacilli的7個類群在根際土和非根際土之間有顯著差異。而在活性細菌群落中，有34個類群在根際土和非根際土之間有顯著差異，其中Oxobacter、Lachnospiraceae、Coprococcus、α-Proteobacteria、Rhodospirillales、Rhodospirillaceae 和Magnetospirillum 的相對豐度在根際土中遠遠高于非根際土（圖3）。
環境因素和根系分泌物對細菌群落的影響
本研究通過CAP分析反映土壤和孔隙水化學性質以及根系分泌物對細菌群落結構的影響（表2）。結果顯示擴增的方式（以DNA或cDNA為模板）分別能解釋基于總OTUs、優勢OTUs和稀有OTUs 43.6%-57.2%、47.7%-61.7%和12.0%-17.4%的結構變化。土壤區域分別能解釋基于總OTUs、優勢OTUs和稀有OTUs 5.1%-5.4%、5.0%-5.9% 和4.4%-4.8%的結構變化。此外土壤區域能夠解釋11.5%-20.8%活性菌在根際土和非根際土中的變化（基于總OTUs：13.8%-18.0%；基于優勢OTUs：14.6%-20.8%；基于稀有OTUs：1.4%-12.4%），TOCpw解釋比例次之（分別解釋9.5%-9.7%、4.3%-10.3%和9.4%-10.4%）。CAP結果表明水稻的生長發育階段（11.5%-11.8%）和草酸含量（10.8%-11.1%）顯著影響活性細菌中稀有OTUs的模式。土壤性質（如NH4+soil、TNsoil和C/Nsoil）、pH和琥珀酸鹽是影響總細菌群落結構重要因素，而水分和NH4+pw分別解釋了總細菌群落10.2%-10.9%和10.4%-10.8%的變化。
表2：不同因素對細菌群落變化影響的CAP分析
總 結
本研究通過水稻不同生長發育階段根際土和非根際土DNA層面的16S rRNA基因和RNA層面的16S rRNA的高通量測序，發現總細菌群落的多樣性高于活性細菌群落的多樣性，而活性細菌對根系變化更為敏感。土壤區域對細菌群落的影響遠大于水稻不同生長時期帶來的影響，尤其在rRNA水平。以上結果表明根際對根際細菌群落結構有重要影響，并且對活性菌和總細菌群落有著不同的影響。
本研究的測序和部分數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
文章索引
Hu Li et al. Distinct rhizosphere effect on active and total bacterial communities in paddy soils. Science of the Total Environment 649(2019):422-430.
