文章題目：Homeotic transformation from stamen to petal in Eriobotrya japonica is associated with hormone signal transduction and reduction of the transcriptional activity of EjAG
發(fā)表期刊：Physiologia Plantarum
技術(shù)手段：RNA-Seq
派森諾生物與西南大學(xué)攜手合作，于2019年10月在《Physiologia Plantarum》上發(fā)表了重瓣花枇杷雄蕊向花瓣同源轉(zhuǎn)化的研究成果，影響因子3。
研究背景：
枇杷是一種亞熱帶常綠喬木，重瓣花枇杷是近幾年才發(fā)現(xiàn)的由雄蕊向花瓣同源轉(zhuǎn)化的自然變種。解析枇杷重瓣花的同源轉(zhuǎn)化機(jī)制有利于更好地理解薔薇科植物花瓣的來(lái)源和多樣性。然而，目前枇杷屬關(guān)于這種同源轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制信息卻很少。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序手段，篩選出與該同源轉(zhuǎn)化相關(guān)的候選基因，結(jié)合對(duì)內(nèi)源激素的研究，共同為揭示同源轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制提供了新觀點(diǎn)。本研究證實(shí)可以編碼C類(lèi)花同源異型蛋白的EjAG基因被顯著下調(diào)。同時(shí)，差異表達(dá)基因的富集分析也揭示了在不同轉(zhuǎn)化階段的差異基因主要參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的代謝途徑。
研究思路：
Step1. 分別取三個(gè)時(shí)期的重瓣花枇杷的花器官（外雄蕊OS，花瓣?duì)钚廴颬O，花瓣P(guān)S）；
Step2. 總RNA提取與測(cè)序；
Step3. 差異表達(dá)基因（DEGs）分析，篩選關(guān)鍵基因；
Step4. EjAG基因的分離與功能分析；
Step5. qRT-PCR驗(yàn)證RNA-seq分析結(jié)果；
Step6. 三個(gè)時(shí)期花器官中的吲哚乙酸、激動(dòng)素、赤霉素和脫落酸濃度的測(cè)定。
研究結(jié)果：
1. 雄蕊向花瓣同源轉(zhuǎn)化的形態(tài)學(xué)分析
如圖1所示，重瓣花枇杷外部的雄蕊轉(zhuǎn)化成花瓣（圖1. B. 紅箭頭），在同源轉(zhuǎn)化過(guò)程中主要有三個(gè)階段：外部的雄蕊OS（圖1. C），雄蕊向花瓣轉(zhuǎn)化PS（圖1. D），轉(zhuǎn)化后的花瓣P(guān)O（圖1. E）。
圖1 枇杷單瓣花和重瓣花的形態(tài)（A.單瓣花，B.重瓣花，紅色箭頭表示由雄蕊轉(zhuǎn)化的花瓣，C.外雄蕊，D.雄蕊向花瓣轉(zhuǎn)化，E.轉(zhuǎn)化后的花瓣）
2.轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，注釋以及DEGs分析
本研究采用每個(gè)樣品6G數(shù)據(jù)量的測(cè)序策略，共獲得135934個(gè)unigene。這些unigene在NR、eggNOG、Swiss-Prot等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋?zhuān)▓D2）。為了評(píng)估在不同轉(zhuǎn)化階段的基因表達(dá)量變化，對(duì)三個(gè)時(shí)期的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況進(jìn)行兩兩比較。在PS vs OS比較組中檢測(cè)到7944個(gè)上調(diào)基因，9441個(gè)下調(diào)基因。PO vs PS比較組中有136個(gè)上調(diào)基因和703個(gè)下調(diào)基因。PO vs OS比較組中發(fā)現(xiàn)8364個(gè)上調(diào)基因和9870個(gè)下調(diào)基因。
圖2 unigene和DEGs分析：A.樣品相關(guān)性分析，B.同源物種分布，C.上調(diào)的差異表達(dá)基因韋恩圖， D.下調(diào)的差異表達(dá)基因韋恩圖
3.影響同源異型轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因的鑒定
轉(zhuǎn)錄因子（TFs）在植物的生物過(guò)程中起著非常重要的作用，特別是在花器官發(fā)育過(guò)程中。關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子基因家族比如 MADS-box , TCP, MYB的表達(dá)量如圖三所示。
圖3 在花器官轉(zhuǎn)錄過(guò)程中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因的分析（A. MADS-box, B. TCP TFs, C. MYB TFs）
4.EjAG的分離、表達(dá)譜及功能分析
來(lái)自MADS-box轉(zhuǎn)錄因子家族的EjAG是一個(gè)C類(lèi)花同源轉(zhuǎn)化基因，屬于rosids euAG家系（圖4）。EjAG的亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)EjAG在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，同時(shí)，RT-PCR定量分析發(fā)現(xiàn)在PO階段EjAG表達(dá)量顯著下降（圖5）。在模式植物擬南芥上進(jìn)行EjAG的功能分析（圖6），進(jìn)一步驗(yàn)證了EjAG的表達(dá)可以挽救花的缺陷。
圖4 C類(lèi)MADS-box蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
圖5 EjAG亞細(xì)胞定位和RT-PCR定量分析，GFP熒光，BF（bright field）, Merged(GFP和BF合并)。
圖6. A. 同源ag-1突變體花瓣，B. 同源ag-1突變體花瓣萼片，C. 擬南芥野生型花，D. E. EjAG轉(zhuǎn)基因小花瓣，F(xiàn). G. 同源ag-1突變體表達(dá)EjAG基因花瓣雄蕊變小，H. 同源ag-1突變體表達(dá)EjAG基因展示正常的花瓣，4個(gè)雄蕊，I. 同源ag-1突變體表達(dá)EjAG基因展示正常的花瓣，6個(gè)雄蕊
5. 激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中DEGs和關(guān)鍵unigene的富集分析
三組差異表達(dá)基因的KEGG富集分析都顯示了在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上有顯著的富集結(jié)果（圖7）。其中關(guān)于生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、脫落酸和乙烯信號(hào)通路相關(guān)的DEGs的表達(dá)水平如圖8所示。
圖7. DEGs的KEGG通路富集分析（A. PS vs OS, B. PO vs PS, C. PO vs OS）
圖 8. 與生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、脫落酸和乙烯信號(hào)通路相關(guān)的DEGs的表達(dá)水平
6.幾種關(guān)鍵同源異型轉(zhuǎn)化相關(guān)基因表達(dá)分析的驗(yàn)證
7個(gè)與花器官相關(guān)的unigene被隨機(jī)挑選用來(lái)做qRT-PCR來(lái)驗(yàn)證兩種技術(shù)下花瓣轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的表達(dá)水平一致。
圖 9. qRT-PCR驗(yàn)證花瓣轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的表達(dá)
7.內(nèi)源激素測(cè)定
用高效液相色譜法HPLC檢測(cè)在不同同源轉(zhuǎn)化階段的內(nèi)源激素的含量變化如圖10 所示。
圖10. 生長(zhǎng)素(IAA)、激動(dòng)素(KT)、赤霉素(GA)、脫落酸(ABA)在花器官轉(zhuǎn)化過(guò)程中的濃度變化
文章小結(jié)：
綜上所述，該研究揭示了重瓣花枇杷雄蕊向花瓣同源轉(zhuǎn)化三個(gè)階段的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和主要的植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，也證實(shí)了EjAG明顯下調(diào)，對(duì)重瓣花形成至關(guān)重要。更重要的是，該研究為揭示其他轉(zhuǎn)錄因子在該同源轉(zhuǎn)化的潛在作用奠定基礎(chǔ)，也為研究枇杷等薔薇科植物的同源異型轉(zhuǎn)化機(jī)制提供了可利用的序列資源。
原文索引：
Jing D.-L., Chen W.-W., Xia Yan, et al. Homeotic transformation from stamen to petal in Eriobotrya japonica is associated with hormone signal transduction and reduction of the transcriptional activity of EjAG. [J] Physiologia Plantarum. 2019.
doi:10.1111/ppl.13029.
文章鏈接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1111/ppl.13029
本研究的測(cè)序和數(shù)據(jù)分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
