文章題目：Tropane alkaloids biosynthesis involves an unusual type Ⅲ polyketide synthase and non-enzymatic condensation
發(fā)表期刊：Nature Communications
技術(shù)手段：無(wú)參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
影響因子11.878。
派森諾生物與中科院攜手合作，于2019年9月在《Nature Communications》上發(fā)表了關(guān)于托品烷的生物合成途徑相關(guān)研究成果。
研究背景
托品烷生物堿（tropane alkaloids）是指一類(lèi)在結(jié)構(gòu)上含有由吡咯環(huán)和哌啶環(huán)駢合而成的托品烷基本骨架的生物堿，是一類(lèi)重要的次生代謝物，具有悠久歷史和重要藥用價(jià)值的植物源天然產(chǎn)物。現(xiàn)存古代醫(yī)學(xué)典籍表明，以托品烷生物堿——莨菪堿和東莨菪堿為藥效基礎(chǔ)的茄科植物，如曼陀羅（Datura stramonium）和顛茄（Atropa belladonna），已經(jīng)有近兩千年的藥用歷史。目前，莨菪堿和東莨菪堿是臨床上廣泛使用的毒蕈堿型乙酰膽堿拮抗劑，用于鎮(zhèn)痛、麻醉、止痙攣、抗暈動(dòng)、帕金森癥治療等，具有很大市場(chǎng)需求。
近百年來(lái)的基于同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的生物合成研究表明，來(lái)源于鳥(niǎo)氨酸的N-甲基吡咯啉陽(yáng)離子（1）和兩分子的乙酰單元構(gòu)成了托品烷基本骨架。然而一直以來(lái)，植物體中催化N-甲基吡咯啉陽(yáng)離子和乙酰單元縮合形成托品烷生物堿基本骨架的酶學(xué)機(jī)制還未見(jiàn)報(bào)道。托品烷生物堿的生物合成研究被相關(guān)的科學(xué)家形容為一個(gè)世紀(jì)難題（Nat Prod Rep 2001, 18, 494）。
研究方法
中國(guó)科學(xué)院，以茄科產(chǎn)莨菪堿和東莨菪堿的代表植物——山莨菪屬三分三（Anisodus acutangulus）、顛茄屬顛茄、曼陀羅屬曼陀羅為研究材料，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。測(cè)序平臺(tái)為Illumina Hiseq。
研究結(jié)果
1. 三種茄科植物 Ⅲ型PKS基因的鑒定——轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
莨菪堿和東莨菪堿存在于多種茄科植物中，包括三分三（Anisodus acutangulus）、顛茄屬顛茄(A. belladonna)、曼陀羅屬曼陀羅(D. stramonium)。構(gòu)建了這三種植物的毛狀根，通過(guò)HPLC分析確認(rèn)了莨菪堿和東莨菪堿的量（圖1），并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。針對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組種內(nèi)差異表達(dá)和種間同源基因分析，發(fā)現(xiàn)了這三個(gè)植物中分別有4,5,2個(gè)潛在的Ⅲ型聚酮合酶unigene，隨后的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2）和氨基酸序列比對(duì)表明，三種不同植物的AbPKS2、AaPKS4、AaPKS2、AbPKS3和DsPKS1屬于一個(gè)分支，其氨基酸序列與文獻(xiàn)報(bào)道的AbPYKS17一致。
圖1 三分三、顛茄屬顛茄、曼陀羅屬曼陀羅三種植物根毛中的托品烷堿HPLC檢測(cè)結(jié)果
圖2 五種潛在的PKS與其他植物細(xì)菌中的三型PKS系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)
2. 測(cè)定潛在 的PYKS的酶活性
為了在功能上明確這些推定的Ⅲ型PKSs，將這5個(gè)蛋白分別在大腸桿菌和丙二酰輔酶a中表達(dá)(圖3)，并在體外分析它們對(duì)底物的活性，化學(xué)合成1(圖4)和丙二酰輔酶a。
圖3 SDS-PAGE分析純化蛋白的體外活性
圖4 N -甲基吡咯烷銨陽(yáng)離子的合成路線
并驗(yàn)證其能催化N-甲基吡咯啉陽(yáng)離子（1）與丙二酰輔酶A縮合形成托品烷生物堿生物合成的關(guān)鍵中間體2。
3. 蛋白晶體結(jié)構(gòu)的研究
植物型PKSs是一類(lèi)已知的催化馬來(lái)酰輔酶a在協(xié)同底物上反復(fù)脫羧縮合的酶，可與芳香環(huán)產(chǎn)生多種天然產(chǎn)物。在本研究中，Ⅲ型PKSs被鑒定為與非共聚系底物1反應(yīng)生成非芳香產(chǎn)物，這表明Ⅲ型PKS有可能成為一個(gè)新的家族。為了了解催化機(jī)理的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，我們?cè)?.0處確定了AaPYKS的晶體結(jié)構(gòu)(AaPYKS- cob，表1;PDB ID: 6 j1m)。二聚體AaPYKS-COB的整體結(jié)構(gòu)與先前報(bào)道的Ⅲ型PKSs的結(jié)構(gòu)高度同源(圖5)。
圖5 AaPYKS-COB (PDB ID: 6J1M)和AaPYKS-6 (PDB ID: 6J1N)的晶體結(jié)構(gòu)。
4. 體外酶促反應(yīng)
體外酶促反應(yīng)發(fā)現(xiàn)這三個(gè) Ⅲ型聚酮合酶利用兩分子的丙二酰輔酶A合成了活性的三羰基戊二酸中間體5。該中間體5能與N-甲基吡咯啉陽(yáng)離子（1）自發(fā)的發(fā)生Mannich縮合，進(jìn)而形成托品烷骨架生物合成的消旋中間體2。
總結(jié)
該研究不僅解決了托品烷生物堿生物合成中基本骨架形成的機(jī)理，回答了長(zhǎng)久困擾學(xué)術(shù)界的一個(gè)科學(xué)問(wèn)題，還發(fā)現(xiàn)了一類(lèi)選擇性合成三羰基戊二酸的新類(lèi)型植物 Ⅲ型聚酮合酶，為基于合成生物學(xué)的莨菪堿藥物的異源生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。100年前Robert Robinson的托品酮（Tropinone）全合成是寫(xiě)入教科書(shū)的天然產(chǎn)物全合成的第一個(gè)經(jīng)典案例，長(zhǎng)久以來(lái)大多科學(xué)家堅(jiān)信該路線是仿生合成。該研究闡釋的托品酮生物合成途徑與100年前的經(jīng)典化學(xué)合成如出一轍，為100年前Robert Robinson的化學(xué)合成是仿生合成提供了直接的證據(jù)，這也是一個(gè)有趣的巧合。
本研究的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和數(shù)據(jù)分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
文章鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41467-019-11987-z
