2019-10-06
期刊：《Science of the Total Environment》
影響因子：5.589
近期，派森諾生物與中國科學院生態環境研究中心合作，在《Science of the Total Environment》（影響因子5.589）發表論文。本研究以人工濕地不同運行階段、不同區域的沉積物樣本為研究對象，結合氨氧化古菌（AOA）amoA功能基因的熒光定量PCR和二代高通量測序技術，展現了AOA在人工濕地系統中的時空變化，深化了人們對人工濕地建立初期古菌氨氧化作用的認識。
研究背景
氨氧化古菌（AOA）廣泛分布在環境中，對氨氧化過程有著十分重要的作用。AOA的生理和生化特點決定了它們的進化和對特定環境的適應。AOA多樣性和群落結構可以改變環境中的氮水平、溫度、pH、植物種類和鹽分等，而環境因素可以改變AOA的行為、結構和演變。
人工濕地（CWs）能夠有效減少水中的營養物質、化學物質和微生物，該處理系統可能導致一些環境因素的變化，如土壤結構特征、營養水平、土壤溫度、有機物含量和水質等，因此可能會影響AOA的群落結構。目前，人們對濕地生態系統演替過程中的AOA群落結構時空變化認識較為匱乏。
研究目的
1. 探究人工濕地SJY-CW沉積物中AOA豐度、多樣性和群落結構的時空變化；
2. 探究AOA群落演變過程中的重要影響因素。
研究方法
測序技術：454高通量測序平臺
測序模式：氨氧化古菌amoA功能基因測序
實驗對象：濕地沉積物
實驗設計：
圖1 SJY-CW濕地取樣圖解
主要研究結果
1. AOA在SJY-CW沉積物中的豐度
AOA amoA基因在SJY-CW沉積物中的拷貝數如圖2所示。總體而言，amoA基因的拷貝數從2011年到2013年逐漸減少，但是其拷貝數在濕地的不同區域有著不同的變化模式。在所研究的3年當中，amoA基因豐度在濕地的inlet和outlet區域十分相近。在2011年和2012年這兩個區域amoA的基因豐度幾乎在一個水平，在2013年兩個區域的基因豐度驟減。與inlet和outlet區域相比，plant-bed系統（West、South和North區域）有著更高的AOA amoA基因拷貝數。此外，amoA基因豐度在plant-bed系統的3個區域有著明顯的地域差異，并且隨著SJY-CW的運行豐度逐漸減小。South區域作為濕地的中心凈化區域，有著最高的AOA amoA基因拷貝數。這些變化模式表明，AOA的豐度變化更容易發生在plant-bed系統。
圖2 SJY-CW運行3-5年期間AOA amoA基因在沉積物中的拷貝數
2. AOA在SJY-CW沉積物中的多樣性
本研究通過454-擴增子測序探究AOA amoA基因在SJY-CW沉積物中的多樣性。15個測序樣本共獲得42159條高質量序列，平均長度為519 bp（359-675 bp）。Good’s coverage指數表明本研究的測序量能夠覆蓋濕地沉積物中的AOA群落（表1）。每個樣本的測序深度歸一化到1500條reads，所有序列以97%的相似度聚類，得到79-224個OTU。各樣本中AOA amoA 基因的多樣性指數如表1所示。
結果表明隨著SJY-CW的運行，AOA多樣性逐漸減少。在所研究的3年當中，AOA在outlet區域的多樣性高于inlet區域。在plant-bed系統中，West區域與其他兩個區域相比有著更高的AOA多樣性。總體而言，AOA多樣性保持著一個相對穩定的狀態（Shannon H 指數：2.98-4.44，變異系數：11.17%）。
表1 AOA amoA基因在SJY-CW沉積物中的多樣性
3. AOA在SJY-CW沉積物中的群落結構
AOA在SJY-CW沉積物中的相對豐度如圖3所示。與數據庫比對發現，SJY-CW沉積物包含廣泛的AOA類型。在所有序列中，有87.26%屬于Nitrososphaera cluster，只有7.88%、4.22%和0.64%分別屬于Nitrosopumilus cluster、Nitrososphaera sister cluster和Nitrosotalea cluster。盡管每個樣本的優勢物種均為Nitrososphaera cluster，其余3類AOA clusters的相對豐度在SJY-CW運行的第4和第5年逐漸增加（圖3），表明在濕地系統運行的過程中，AOA群落結構由相對均勻的分布向高度多樣化轉變。
圖3 AOA amoA基因簇在SJY-CW沉積物中的相對豐度
Nitrososphaera cluster可以被分為7個主要的subclusters（subclusters 1、3、4、6，8-10），Nitrosopumilus cluster可以被分為subclusters1和5（圖4）。Nitrososphaera cluster 9、3、10和4為絕大多數樣本中的優勢物種，除了2013-North和2013-Outlet兩個樣本。而2013-North的優勢物種為Nitrososphaera subcluster 9和Nitrosopumilus subcluster 5，2013-Outlet的優勢物種為Nitrososphaera subclusters 10和1。Nitrososphaera subcluster 1和Nitrosopumilus subclusters 1、5可以標志濕地的具體區域。Nitrososphaera subcluster 1在樣本2013-Outlet有著顯著的增長趨勢。Nitrosopumilus subclusters 1、5在沉積物中有著類似的變化趨勢：2011年，Nitrosopumilus在每個區域都非常少；2012年，這兩個subclusters在上游采樣區增加；隨后，隨著濕地的運行，Nitrosopumilus逐漸減少，最后在濕地的末端區域表現為增加。
圖4 AOA 群落在SJY-CW運行過程中的演化
4. AOA在SJY-CW沉積物中的群落結構變化
基于Bray-Curtis距離矩陣，SJY-CW沉積物中的AOA amoA基因庫被分為8組（P<0.05）（圖5）。圖中的紅色區域表示AOA群落的時空變化。這8個組沒有按運行時間（運行年份：2011-2013）或采樣區域（Inlet、West、South、North和Outlet）而表現為時間和空間的交互分隔。結果表明隨著SJY-CW的運行，AOA群落結構有著空間的分化，并且主要發生在Plant-bed系統中。
圖5 基于Bray-Curtis距離的UPGMA聚類圖
RDA冗余分析顯示3年的樣本只有部分相互重疊，表明AOA的群落結構主要受SJY-CW次生演替的影響（圖6）。在空間維度，5個不同區域的樣本在2011年距離較近，在2012年和2013年距離加大，進一步表明AOA群落結構由相對統一到加大多樣性分化。同時，RDA分析展現了AOA群落結構和環境因子的關系。環境因子解釋了AOA組成總變異方差的50%。其中Days（運行時間，F=1.5145，P=0.055）綜合反映了水文、水質及相關功能，對SJY-CW沉積物中AOA結構與環境的關系具有重要意義；溫度和營養成分（NH+4-N、TC、TN、TS和C/N）對AOA群落結構也有重要影響。
圖6 AOA群落結構和環境因子的RDA分析
總結
本研究通過實時熒光定量PCR技術、454-擴增子高通量測序技術，結合聚類分析和RDA冗余分析，得出以下結論：
1. 氨氧化古菌AOA群落結構在SJY-CW運行的第三到第五年中有著很大的時空變化；
2. AOA的絕對豐度在復雜的plant-bed系統顯著高于其他較均勻的取樣區；
3. 隨著濕地系統的運行，AOA群落結構由較均勻的分布到多元化轉變；
4. 濕地系統的運行時間對AOA的群落結構有主要影響，溫度、營養元素影響次之。
本研究的測序和部分數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
文章索引
Weidong Wang et al. Spatiotemporal shifts of ammonia-oxidizing archaea abundance and structure during the restoration of a multiple pond and plant-bed/ditch wetland. Science of the Total Environment 684 (2019) :629–640
