2019-09-05
最近，派森諾生物與中國農業科學院合作，在《Biology and Fertility of Soils》（影響因子4.829）發表論文，探討豬糞廢水交替溝灌處理后土壤中氮的主要轉化過程、細菌和真菌的群落組成以及氮循環相關基因相對豐度的變化。
研究背景
循環利用營養豐富的牲畜廢水并將其用于灌溉是一種有吸引力的方法，可緩解缺水壓力，捕獲植物生物量和土壤中的氮和其他營養物質，并以有管理的方式處理廢物。富營養化廢水灌溉可能改變土壤的氮轉化，包括硝化、反硝化、固氮、厭氧氨氧化和完全氨氧化。N2O是比CO2強300倍的溫室氣體，也是造成臭氧消耗的原因。因此，減少其耕地排放是必要的。
在干旱和半干旱地區，交替溝灌（AFI）已被開發為一種有效的節水灌溉方法。AFI交替灌溉相鄰的兩個犁溝，使根系長時間保持在干旱犁溝中，刺激脫落酸（ABA）的合成，試圖降低葉片氣孔導度，最終降低植物蒸騰作用。與傳統的溝灌相比，AFI具有降低N2O排放的潛力，但其對土壤中氮循環基因豐度的影響尚不清楚。
研究目的
鑒于AFI和灌溉中廢水使用的增加，作者研究了在AFI下用不同量豬糞廢水灌溉的辣椒田中氮循環基因的豐度和主要氮轉化過程的響應。對于每種處理，都有地下水灌溉對照。在所有處理和對照中，測量了主要的氮轉化活性、氮循環基因的分布、細菌和真菌群落的組成，并分析了它們與土壤因子的關系。這將填補用廢水交替溝灌如何影響氮轉化活動及其相關基因的知識空白，為干旱半干旱地區畜牧業廢水的可持續利用提供氮管理參考。
材料與方法
測序技術
Illumina MiSeq高通量測序平臺
測序模式
微生物組細菌16S rRNA基因V3-V4區測序
實驗設計
實驗中使用的植物是辣椒
（Capsicum annuum L.，Fulong F1），
樣品是種植辣椒的土壤。
表1 分組設計
結 果
1、土壤化學性質的變化
AFI處理后的土壤NO3--N含量明顯低于CFI處理，在塊狀土壤中差異顯著（80%）。對于土壤中的交換性NH4+-N，50%和60%比例地下水的AFI比根際和塊狀土壤的CFI含量高，65%和80%比例廢水的AFI和塊狀土中50%比例廢水的AFI差異不顯著。地下水灌溉下土壤pH比污水灌溉下高，而OM、TN和NO3?-N含量以及C/N比則相反。在所有處理中，塊狀土壤的EC和NO3?-N均高于根際，而OM和交換性NH4+-N則相反。三種AFI處理土壤化學性質無顯著差異。
表2 不同處理土壤的化學性質
2、N轉換活性
廢水處理的總氮輸入高于地下水處理，但廢水處理的氮利用效率明顯較低。水源對氮素利用率有顯著影響，而灌溉量對氮素利用率無顯著影響。各廢水灌溉率間氮素利用率無顯著差異。與CFI相比，AFI顯著提高了地下水處理的N利用效率，且在較高的AFI比例下，其效率有所提高，但并不顯著。在不同水源條件下，3種AFI處理下植物對N的吸收差異不顯著，但是CFI時植物N吸收顯著低于80%比例地下水灌溉的AFI，同時CFI植物N吸收顯著高于50%比例廢水灌溉的AFI。根際硝化速率受水源的影響較大，但不受灌溉量的影響。地下水灌溉體土壤硝化活性無顯著差異;在污水灌溉的塊狀土壤中，80%的AFI的硝化活性明顯高于50%。不同水源、不同灌溉量下土壤的反硝化速率無顯著差異。廢水灌溉根際，CFI的反硝化活性高于AFI處理，且明顯高于65% AFI處理。所有土壤中均未發現固氮現象。
圖1 土壤的硝化速率和反硝化速率。
RS為根際，BS為塊狀土壤，G為地下水，W為牲畜廢水，C為常規溝灌，A為交替溝灌。100、50、65、80分別為每小區全部灌溉水量的100%、50%、65%、80%。數據用均數±標準差表示。不同的小寫字母代表處理組間差異有統計學意義（p < 0.05）
3、細菌和真菌群落結構
稀疏曲線表明測序深度足以覆蓋微生物多樣性。土壤類型（根際與塊狀土壤，R2 = 0.107，p = 0.002）和灌溉水源（地下水與廢水，R2 =0.222，p < 0.001）對細菌OTU均有顯著影響。與地下水灌溉土壤相比，廢水灌溉土壤中細菌OTU的變異性有所降低，但不同灌溉量并未引起細菌OTU組合的顯著差異。對于真菌，只有根際和塊狀土壤的OTU存在顯著差異（R2 =0.181，p < 0.001）。
圖2 基于OTU加權UniFrac距離的
土壤細菌(a)和真菌(b)群落的無約束主坐標PCoA分析
4、細菌和真菌OTU的顯著差異
對于細菌，與廢水灌溉土壤相比，地下水灌溉土壤中OTU的豐度顯著增加。根際土壤中豐度明顯較高的OTU數量與塊狀土壤相似。各樣本中的門和綱存在顯著差異。比如，在地下水灌溉土壤中顯著較高的OTU為Acidobacteria(占總OTUS的23.5%)或Gemmatimonadetes(22.6%)，而廢水灌溉土壤中顯著較高的則是Bacteroidetes(22.2%),α-Proteobacteria(22.2%),γ-Proteobacteria(20.2%)和Actinobacteria(14.1%)。對于真菌，地下水灌溉土壤中豐度顯著增加的OTU數量高于廢水灌溉土壤。根際和塊狀土壤豐度顯著增加相關的OTU數量相同，與細菌OTU相似，但真菌的數量較少。對于根際豐度顯著增加的OTU，在廢水灌溉下顯示出顯著增加的OTU數量高于地下水灌溉，而在塊狀土壤中則相反。
圖3 土壤中細菌（a）和真菌（b）OTU的數量
5、N循環相關基因的相對豐度
（熒光定量qPCR檢測）
1）根際和土壤中的水質效應
根際和塊狀土壤的基因豐度受水源和灌溉率的影響顯著。灌溉水源不同，N循環相關基因豐度存在顯著差異。在根際，基因形成三組：第一組由amoB，nirK和nosZ組成，隨著硝酸鹽，反硝化速率的增加和廢水灌溉土壤pH值的降低，豐度增加；第二個由nirS和nifH組成，與廢水灌溉產生的OM和硝化速率增加密切相關；第三組由amoA組成，與地下室灌溉引起的pH增加顯著相關。土壤pH、OM、硝酸鹽和反硝化速率均與水源分離有關。硝酸鹽濃度的增加和pH值的降低確實導致了大量的變異，并且與amoB基因豐度的增加和amoA基因豐度的減少有關；nosZ和nirK基因的豐度分別與EC和TN的增加有關。在廢水灌溉條件下，硝態氮和全氮均有所增加，但受灌溉率的影響不同。
圖4 土壤中N循環相關基因相對于施肥和耕作前的豐度
圖5 根際（a）和塊狀土壤（b）中N循環相關基因豐度
與環境因子的冗余分析
2）交替溝灌與灌水量的影響
除amoA外，廢水灌溉土壤的基因豐度均高于地下水灌溉。在不同灌溉比率下，無論水源是什么，基因豐度都存在顯著差異，這一差異在塊狀土壤中比在根際更為顯著。當用廢水灌溉時，相對于CFI，AFI以50%比率顯著降低了根際土壤中amoB，nifH和nirS的豐度，以及塊狀土壤中nosZ，nosZ / nirK和nosZ / nirS的豐度，但是增加了塊狀土壤中amoB和nifH以及根際土中amoA的豐度。隨著AFI比率的降低，土壤中nifH的豐度增加。在塊狀土壤中，隨著灌溉比率從50%增加到65%和80%，nirK豐度也隨之增加，但灌溉比率越高，土壤豐度的方差越大。當灌水量由高減少到低時，兩種土壤分區的amoB豐度均有所增加，amoA豐度在根際與amoB豐度呈相同的趨勢，而在塊狀土壤中則相反。根際中對于nosZ基因編碼的亞硝酸鹽還原酶在50%比率下的豐度顯著高于其他兩種比率。
總 結
該研究研究了不同灌溉比率下的地下水和廢水來源AFI和CFI后土壤中N轉化活性和相關N循環基因分布的差異。與CFI相比，地下水灌溉的AFI增加了植物氮素利用率。水質對基因豐度的傳播有明顯的影響：與地下水相比，廢水灌溉對基因的響應性更強。相比于CFI，廢水灌溉的AFI減少了根際中除了amoA之外的其他基因的豐度。廢水灌溉下的AFI，增加灌水量可以增加根際土壤中nirK和nirS的豐度，降低amoA，amoB，nifH和nosZ的豐度，但是不會降低反硝化速率，同時保持塊狀土和根際土中反硝化速率不變，揭示了AFI的灌溉量并沒有同時改變N轉化過程和土壤中相關N循環基因的豐度。
研究結果表明，適當的灌溉比率具有提高氮素利用率的潛力，具有重要的應用價值。
本研究的測序和部分數據分析工作
由上海派森諾生物科技股份有限公司完成
文章索引：
Liu Y , Neal A L , Zhang X , et al. Increasing livestock wastewater application in alternate-furrow irrigation reduces nitrification gene abundance but not nitrification rate in rhizosphere[J]. Biology and Fertility of Soils 2019.
