2019-08-22
期刊：Bioresource Technology
影響因子：6.669
派森諾近期與黑龍江八一農墾大學合作，在《Bioresource Technology》（影響因子:6.669）發表文章，對生物預處理玉米秸稈可提高厭氧消化系統中甲烷產量的現象進行了研究探討。通過對未處理和預處理的秸稈樣品進行DNA水平的16S rRNA基因測序與RNA水平的16S rRNA測序以及宏轉錄組測序分析，獲得樣品中的菌群結構及活性菌群變化情況，同時根據宏轉錄組測序的結果定向檢測產甲烷峰值期樣品中功能、代謝途徑的變化特征。
研究背景?
玉米秸稈是中國主要的農業廢棄物，生物質循環是減少填埋或焚燒有機物質造成環境壓力的主要解決方案。玉米秸稈可作為厭氧消化（AD）生產甲烷的主要原料，而甲烷是生物質能量的重要組成部分。木質纖維素是一種復雜的大分子，是秸稈細胞壁的主要成分，而植物細胞壁對微生物和酶解構具有耐受性。由于其結構和化學性質，木質纖維素的水解是AD的限速步驟之一。所以對秸稈進行預處理是增加厭氧消化中甲烷產量的有效方法。
微生物生物預處理被認為是促進生物降解和增加秸稈沼氣生產的有效方法，具有低能耗和安全等優點。其中微生物復合菌系可以通過顯著增加厭氧消化早期的甲烷產量來提高AD活性的產甲烷效率。以前的研究將注意力集中在預處理階段，并系統地分析了木質纖維素在該過程中的分解機理。這包括對上游階段微生物群落多樣性和組成功能的分析。但預處理對AD系統中微生物的重要性還沒有得到足夠的重視。特別是，增加甲烷產量與AD系統中微生物群落結構、活性和功能表達的變化之間的關系需要進一步探索。
本研究中，作者同時進行了以DNA水平的16S rRNA基因測序和RNA水平的16S rRNA測序以及宏轉錄組分析，分別從菌群結構及活性菌群兩種水平探討了微生物群落在厭氧消化過程中的結構、活性、功能、代謝途徑的變化。本文的研究針對微生物復合菌系對預處理條件的逆向優化以及如何發揮更大的潛力具有重要意義，同時也為預處理中微生物的篩選提供了依據。
研究方法?
測序技術：Illumina MiSeq與Illumina HiSeq X-ten高通量測序平臺
測序模式：微生物組16S rRNA基因與16S rRNA V4區測序、宏轉錄組測序
實驗設計：收集產甲烷峰值期（進料后24小時）和穩定期（進料后48小時）的污泥樣品。通過在4℃以13,400 g離心15分鐘使樣品沉淀，并立即用于DNA和RNA提取，進行16S rRNA V4區多樣性組成譜測序；另對產甲烷峰值的樣品進行宏轉錄組測序。
研究結果
微生物結構群落及整體活性變化
微生物群落組成和活性微生物群落聚集在PCA主成分分析圖的兩個不同的區域。對于DNA水平的微生物群落，未處理的秸稈和預處理的秸稈的兩個時期中的所有樣品聚集在右側。在沼氣生產的峰值和穩定階段的樣本的聚類結果中，未處理的秸稈和預處理的秸稈的群落結構僅存在微小差異。兩個時期的樣品中，RNA水平的活性微生物群落都聚集在左側，并與DNA水平的微生物群落結構的聚類結果分開。在沼氣生產的高峰期和穩定期，生物預處理中的活性微生物群落與未處理的秸稈中活性微生物群落顯著不同。
主要微生物與微生物功能研究
RNA水平的多樣性組成譜分析顯示，生物預處理組中最活躍的微生物是Methanosaeta，在高峰期具有10.8％的豐度。雖然在穩定期其豐度降至6.9％，但仍顯著高于未處理秸稈組的豐度（P<0.01）。豐度排名第二的微生物是Longilinea，在高峰期活動為6.8％，穩定期活性降至4.3％。Methanoculleus（一種僅次于Methanosaeta豐度的古細菌）的豐度分別在高峰期和穩定期分別為2.5％和2.0％。在未處理秸稈組的高峰期和穩定期期間，最活躍的微生物是Ruminofilibacter。Methanosarcina 的豐度顯著低于Ruminofilibacter，其豐度在峰值和穩定期分別達到5.2％和3.3％，成為兩個時期最活躍的古菌。Methanoculleus 的豐度也值得關注，在高峰期豐度為4.2％。在未經處理的秸稈中，主要基質是玉米秸稈，具有木質纖維素降解能力的一些細菌成為優勢微生物的事實是有意義的。許多研究還報道了這些微生物在AD系統中占主導地位，同時該研究還發現產甲烷古菌是甲烷產量高峰時菌群結構中最活躍的微生物。
使用Metastats分析了屬水平上物種的顯著差異。對于微生物群落的組成，微生物數量存在顯著差異，在沼氣生產高峰期未處理的秸稈和預處理的秸稈中有48個屬，在穩定期有51個屬。對于活性微生物群落，在高峰期未處理的秸稈和預處理的秸稈之間有63種不同的屬，在穩定期有58種。
微生物群落功能的變化
不同的產甲烷古菌在產甲烷途徑中起不同的作用。產甲烷效率的提高是菌群結構的直接表現。分析菌群結構的功能變化更有利于解釋生物預處理的影響。在KEGG代謝通路分析中，發現兩者表達水平顯著不同，排在前十位的代謝途徑也是如此。在生物預處理秸稈組和未處理秸稈組中，甲烷代謝（ko00680）與碳代謝（ko01200）基因表達差異最大。甲烷代謝是AD系統中最重要的功能，碳代謝與甲烷代謝密切相關。
生物預處理和未經處理的秸稈在甲烷代謝方面存在顯著差異，同時甲烷代謝也與甲烷的產生直接相關。因此，探索甲烷代謝的內在途徑變化具有重要意義。在KEGG基因表達水平上來看，共有17個KOs表達水平有顯著差異，14個與產甲烷直接相關的KOs在生物預處理中顯著上調。涉及Mcr、Mtr、Acss、Fwd、Frh以及Mvh等四種關鍵酶和兩種輔酶基因的表達。
總結
厭氧系統中的微生物群落結構受底物變化影響較小，其穩定性確保了甲烷的連續生產。然而，活性菌群表現出了一定的靈活性，在使用預處理的秸稈消化過程中，豐度最高的產甲烷古菌發生了變化。在產甲烷古菌中，Methanosaeta 通過對乙酸的特殊捕獲能力，對提高產甲烷效率做出了最重要的貢獻。總體而言，經歷生物預處理的材料消化過程中的甲烷生成量有顯著提高。
參考文獻
Zhao Y, Xu C, Ai S, et al. Biological pretreatment enhances the activity of functional microorganisms and the ability of methanogenesis during anaerobic digestion[J]. Bioresource Technology, 2019: 121660.
