2019-08-21
文案 | 基因組產品線
近日，派森諾生物與江蘇省農科院獸醫研究所攜手，在微生物基因組領域 American Society for Microbiology 的《Antimicrob. Agents Chemother》（影響因子4.715）成功發表！
本研究的目的是探索大腸桿菌（E. coli）對氟喹諾酮（fluoroquinolone, FQ）類抗生素的遺傳特性、耐藥模式和耐藥機制。將之前臨床獲得的E. coli活化后進行藥敏實驗和分子分型檢測。目前已知的FQ耐受機制有：
? 靶位點變異；
? 質粒攜帶的獲得性耐藥基因（PMQR基因）；
? 相關的分子外排泵和孔蛋白相關的表達基因的變化。
本研究用DNA測序和qPCR的方法檢測對上述3種耐藥機制的相關基因做檢測，利用高通量測序技術對其中有代表性的11株菌進行重測序，并檢測SNP位點。
實驗材料
用Salmonella Typhimurium CVCC541飼喂孵化4天的雞仔，被感染的雞仔被隨機分成5組，然后從第8天連續7天分別喂食這些雞仔不同劑量（100, 4, 0.1 and 0 mg/kg b.w.）的恩諾沙星（enrofloxacin）然后停藥7天，重復3輪。分別在3, 7,8, 11, 14, 15, 18, 21, 22, 25, 28, 29, 32, 35, 36, 39, 42, 43, 46和第49天取雞仔的肛門擦拭取樣，并涂布在不同含量（0, 0.125, 0.25 and 2 mg/L）的恩諾沙星的固體培養基上，每個時間點取2個克隆。用生化檢測和16s鑒定的方法鑒定培養基上的大腸桿菌。
本研究共分離到330個大腸桿菌，其中115個菌株從中等用藥組（4 mg/kg b.w.）的第46天和49天分離得到；215株高劑量（100 mg/kg b.w.）用藥組的第35天到第49天分離得到。低劑量用藥組和空白對照組沒有分離出大腸桿菌。
圖1 分離到的大腸桿菌隨時間變化對幾種藥物的最低耐藥劑量分析
Fig. 1 MIC distributions of the E. coli isolates to enrofloxacin, amoxicillin/clavulanic acid, ampicillin, sulfamethoxazole/trimethoprim, gentamicin, tetracycline, chloramphenicol and ceftiofur along with time
從上圖可以看出，分離到的大腸桿菌對不同的藥物均產生了一定程度的耐藥性，這表明從喂食恩諾沙星治療感染沙門氏菌（Salmonella）的雞仔身上分離得到的大腸桿菌有多重耐藥性。可以推測恩諾沙星誘導了大腸桿菌產生了多重耐藥性。
根據這些菌的遺傳特征、毒力因子基因型、ERIC-PCR(大腸桿菌細菌基因組指紋分析)、最小抑菌濃度（MICENR）和質粒介導的喹諾酮抗性基因（plasmid-mediated quinolone resistance, PMQR genes）被分成18個亞群。
表1 根據遺傳特征、恩諾沙星敏感性和抗藥機制將分離到的大腸桿菌分為18個亞群
Table 1 Eighteen subgroups of the E. coli isolates classified by genetic characterizations, susceptibility to enrofloxacin and resistance mechanisms
從每個亞群中挑出1個代表菌株和非耐藥菌株E. coli ATCC25922菌株一起檢測編碼外泵蛋白的基因（acrA, mdfA, ydhE, acrE, tolC, mdtE 和mdtF）及其調控基因（marA, soxS, fisF, dsrA 和evgA）和孔蛋白編碼基因（ompC 和ompF）的表達情況。結果如下圖：
圖2 外泵基因、調控基因和孔蛋白基因的表達水平
Fig. 2. Relative expression levels of effux pumps. Porins and regulators.
備注：不同顏色的柱子代表菌株的MIC（藍色，MIC=8 mg/L；紫色，MIC=16 mg/L；紅色，MIC=32 mg/L；黃色，MIC=64 mg/L；綠色，MIC=128 mg/L；灰色，MIC=256 mg/L）
與對照組（ATCC 25922）相比，18株分離菌的外排泵編碼蛋白相關基因（acrA, acrE,tolC, mdtE, mdtF, mdfA, ydhE）的表達都有一定的增加。孔蛋白編碼基因ompF 的表達量在耐藥性較低的6個菌株中有顯著降低，在耐藥性高的菌株中無顯著差異；ompC 基因的表達量在17個菌株中顯著增加，在1個菌株中有輕微降低。5個相關的調控基因（marA, soxS, fisF, dsrA, evgA）在18個菌株中的表達各有差異。
根據這些基因的表達情況，篩選了11個菌株做高通量測序，得到的數據以E. coli CVM N37067PS為參考基因組做重測序分析，鑒定單核苷酸多態性（SNPs）位點。我們著重分析在11個測序樣品中都有，或在7個高耐藥菌株中有在4個低耐藥菌株中沒有的SNP位點并驗證。
最終找到了GyrA 基因上的雙突變（S83L和D87N），基因ParC 和ParE 突變S80I和S458E，分子外排泵和QnrS1 蛋白的激活；低耐藥性主要與孔蛋白OmpF 的表達降低，分子泵的活性以及基因aegA上的A1541G突變有關，其中基因aegA 上的A1541G變化可以將E. coli 的MICENR降低一半。
結 論
1、從用恩諾沙星治療感染了Salmonella 的雞仔腸道中分離出來的大腸桿菌具有多重耐藥性；
2、孔蛋白編碼基因ompF 的表達量在耐藥性較低的6個菌株中有顯著降低，位于質粒上的基因qnrS1編碼的蛋白具有顯著降低大腸桿菌的耐藥性，同時ParE 基因對提高菌株的耐藥性有明顯作用；
3、基因aegA上的A1541G變化可以將E. coli 的最小抑菌濃度MICENR值降低一半。?
本研究的大腸桿菌重測序和部分數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
文章索引
Li J, Hao H, Dai M, Zhang H, Ning J, Cheng G, Shabbir MAB, Sajid A, Yuan Z. 2019. Resistance and virulence mechanisms of Escherichia coli selected by enrofloxacin in chicken. Antimicrob Agents Chemother 63:e01824-18. https://doi.org/10.1128/AAC.01824-18.
