2019-07-19
文案 | 微生物組產品線
正 文
最近，派森諾生物與四川大學合作，在《International Journal of Food Microbiology》（影響因子4.006）再次發表論文，將特定功能物種Monascus purpureus（紅曲）添加到四川麩醋的發酵裝置中，并結合細菌16S rRNA基因測序與真菌ITS測序，分析了紅曲的添加對麩醋發酵過程中微生物群落以及代謝物的影響。
研究背景
四川麩醋（SBV）是我國四大名醋之一，也是我國麩醋的代表。麩醋在制作中主要涉及糖化、酒精發酵和醋酸發酵這三個階段，且每個階段都與微生物密切相關。近年來，越來越多的研究者開始關注在醋的生產過程中微生物群落結構的改變，以期通過改善發酵過程中的微生物群落結構來提高醋的生產效率。有研究表明，投菌法能夠提高中國傳統固態發酵過程中代謝物的產生并調節微生物群落的多樣性。
Monascus purpureus（紅曲）是一種常見的功能性真菌，能夠產生多種有價值的化合物，比如C-氨基丁酸、單胞菌素K和紅色素，且已經被用到了福建紅醋的生產中。因此，本文將研究紅曲對四川麩醋，及其醋醅中主要代謝產物和微生物群落的影響，以期建立能夠在麩醋生產過程中調節微生物群落及其代謝產物的生物調節技術。
研究內容與目的
探究紅曲對四川麩醋及其醋醅中主要代謝產物和微生物群落的影響。
材料與方法
實驗設計
01
制作添加了紅曲的SBV發酵裝置，室溫發酵30天后，發酵混合物轉變為新鮮醋醅，此時用鹽覆蓋將其催熟，然后將浸泡出的液體煮沸以得到新鮮的醋；隨后將得到的部分醋醅混合到新的SBV發酵裝置中，在第二次發酵成熟并用鹽覆蓋前，分別于發酵裝置表面、中部、底部取醋醅樣本，混合均勻后于-20℃存放;提取醋醅樣本中的總DNA，用于高通量測序研究；測定生醋樣本中的有機酸與揮發性成分。
表1 各發酵裝置的處理信息
結果與討論
1、醋醅中的微生物多樣性
各樣本中微生物的α多樣性指數如表2所示，可以發現，添加紅曲后，醋醅中真菌與細菌的微生物多樣性均顯著降低，且紅曲對細菌多樣性的影響要大于對真菌多樣性的影響。
表2 各樣本中真菌與細菌群落的Alpha多樣性指數
基于主要細菌與真菌類群的熱圖分析結果顯示（圖1），添加紅曲與未添加紅曲的樣本在聚類時被分為了兩組，同時，對于添加了紅曲的三組樣本來說，由于H4中添加的紅曲比例要高于H2和H3，其主要微生物類群也和H2、H3之間有所差異。
圖1 醋醅樣本中細菌（A）與真菌（B）群落中主要微生物類群的熱圖分析
NMDS分析顯示，醋醅中的細菌與真菌的微生群落組成與結構均受到了紅曲的影響，且H0與H4之間的菌群差異是最明顯的。
圖2 各樣本中細菌與真菌群落的NMDS分析
不同醋醅樣本中的微生物群落結構
本次研究在所有樣本中測得的微生物類群主要歸屬于6個細菌門類、4個真菌門類，其中細菌主要以厚壁菌門和變形菌門為主，總相對豐度高達99%，真菌主要以子囊菌門為主，相對豐度高達96%。與此同時，不同紅曲添加比例醋醅中的主要微生物類群也有明顯差異（圖3）。
圖3 醋醅樣本細菌（A）與真菌群落（B）中的主要微生物類群
2. 紅曲對生醋中有機酸與主要揮發性物質的影響
本研究主要檢測了6種有機酸，即乳酸、乙酸、L-焦谷氨酸、草酸、檸檬酸和L-蘋果酸。結果顯示，添加紅曲后的生醋中總有機酸平均濃度是未添加紅曲的兩倍，其中，生醋中乳酸和乙酸的含量分別增加了2.12和1.84倍。
同時，本研究共檢測到了59種揮發性成分，其中，主要揮發性成分共11種（見圖4B），統計結果顯示，紅曲的添加對生醋中的揮發性成分具有顯著影響，添加紅曲后的生醋中酯類與醇類物質的濃度分別增加了1.3倍與2.55倍，且SBV中的原始主要揮發性成分并未受到紅曲的影響。
圖4 不同生醋中有機酸（A）與主要揮發性物質（B）的差異分析
微生物與代謝物之間的聯系
SBV發酵過程中優勢屬的代謝圖譜如圖5A所示，木霉菌促進了纖維素與半纖維素的降解，并將它們轉化為可發酵的單糖，隨后發酵物質轉化為了使乳酸與酒精發酵的關鍵代謝產物丙酮酸，同時，乳酸菌和念珠菌分別是參與乳酸和酒精發酵的主要微生物。
PICRUSt功能預測的結果顯示（圖5B），添加紅曲后的樣本中，參與氨基酸、碳水化合物（尤其是淀粉和蔗糖）、脂類、丙酮酸和苯丙氨酸代謝的功能基因豐度是未添加紅曲樣本的1.28~2倍，尤其是和苯丙氨酸代謝有關的功能基因，在H2、H3和H4中的豐度是未添加紅曲樣本的2.59、3.91和6.68倍，除此之外，預測結果顯示，一些參與TCA循環的基因豐度也有所增加。
綜上所述，添加紅曲后，樣本中的微生物群落發生了改變，功能預測結果中，參與氨基酸、碳水化合物（尤其是淀粉和蔗糖）、脂類、丙酮酸和苯丙氨酸代謝的基因豐度也得到增強，這些在實驗中表現為生醋里對應的代謝物的積累（β-苯乙醇、乙酸苯乙酯、檸檬酸和L-蘋果酸）在添加紅曲后明顯增加。
圖5 發酵過程中優勢屬的代謝圖譜（A），醋醅樣本中細菌群落的PICRUSt代謝功能預測結果（B）
總 結
本文結合了細菌16S rRNA基因測序與真菌ITS測序，分析了紅曲的添加對麩醋發酵過程中微生物群落以及代謝物的影響，并得到以下結果：
本研究的測序和部分數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
文章索引
Ai M, Qiu X, Huang J, et al. Characterizing the microbial diversity and major metabolites of Sichuan bran vinegar augmented by Monascus purpureus[J]. International journal of food microbiology, 2019, 292: 83-90.
