2019-07-02
期刊：PLOS Pathogens
影響因子：6.158
文章題目：Schistosoma japonicum extracellular vesicle miRNA cargo regulates host macrophage functions facilitating parasitism
技術手段：small RNA-Seq和RNA-Seq
派森諾生物與中國農業科學院上海獸醫研究所攜手合作，于2019年6月4日在《PLOS Pathogens》上發表了有關日本血吸蟲miRNA調節宿主免疫應答促進寄生蟲存活的研究成果，影響因子6.158。
研究背景
寄生蟲與宿主外周血免疫細胞密切接觸，但對寄生蟲與這些免疫細胞之間的調節相互作用知之甚少。因此，闡明血吸蟲存活的機制不僅有助于理解宿主-寄生蟲相互作用，也有助于針對血吸蟲病的新策略的發展。而細胞外泌體（EV）及其miRNA載體已被證明是參與許多生物過程調節的細胞間通訊的介質。
研究方法
血吸蟲細胞外泌體Small RNA-Seq、小鼠細胞RNA-Seq、qPCR、流式細胞術、細胞轉染、蛋白質免疫印跡等
研究結果
01 血吸蟲細胞外泌體SjEVs及其miRNA的表征
qNano分析表明SjEV的大小范圍為100nm至400nm（圖1A）。蛋白質免疫印跡表明，分離的SjEV含有幾種已知的外來體標志物，包括GAPDH，HSP70和HSP90（圖1B）。接下來，使用高通量測序，作者確定了與SjEV相關的小RNA群。
生物信息學分析表明，SjEV中相對大百分比的小RNA是miRNA（32％）（圖1C），包括miR-125b，miR-61，miR-3505和寄生蟲特異的bantam miRNA。SjEV miR-125b在SjEV中持續且高度富集，占三個生物重復中的總miRNA讀數的64.21％，使用RT-qPCR驗證了這幾種miRNA的相對豐度（圖1E）。
圖1 SjEVs及其載運miRNA的表征
02 日本血吸蟲EVs主要由宿主外周血單核細胞攜帶，并將其載運miRNA轉移到受體細胞中
成體血吸蟲可以與宿主外周免疫細胞密切接觸，存在于宿主腸系膜靜脈中數十年。
為了確定SjEV是否被攝取并調節宿主外周免疫細胞（圖2A），作者將體外PKH67標記的SjEV與鼠外周免疫細胞一起孵育。然后使用流式細胞術分選外周免疫細胞以區分CD3eT細胞，B220 B細胞，CD11b + Ly6C +單核細胞和NK1.1細胞，并定義標記的EV攝取到不同的免疫細胞中。
SjEV主要在單核細胞中鑒定，然后是T細胞，B細胞和NK細胞（圖2B和2C）。使用通過尾靜脈注射PKH67標記的SjEVs的小鼠的實驗證明SjEVs也被體內外周免疫細胞攝取（圖2D）。如圖2E和2F所示，盡管攝取在體內看起來不是選擇性的，但是注射后4小時和12小時PKH67標記的SjEV在小鼠單核細胞中最高，與體外結果一致。來自日本血吸蟲感染小鼠的外周血免疫細胞的分析表明，在自然感染期間，miR-125b，bantam，miR-61，miR-277b也被攝取并存在于外周免疫細胞中（圖2G）。
值得注意的是，與攝取較少SjEV的NK細胞相比，這些日本血吸蟲miRNA在單核細胞中顯著更豐富（圖2H）。總之，這些結果表明日本血吸蟲EV主要宿主單核細胞攝取，其載運miRNA轉移到受體細胞中。
圖2 宿主外周血免疫細胞對SjEVs及其miRNA載運量的評估
03 日本血吸蟲EV miRNA在受體細胞中具有功能相關性
為了開始實驗以確定SjEV miRNA是否可以功能性調節宿主受體細胞內的RNA，作者首先使用Exo-Glow外泌體標記試劑盒標記SjEV RNA，將標記的SjEV與小鼠巨噬細胞細胞系（RAW264.7細胞）一起孵育，使用熒光用顯微鏡檢查SjEV攝入細胞，然后確定SjEV miRNA是否轉移到受體細胞中。如圖3A所示，標記的SjEV被RAW264.7細胞攝取。RT-qPCR分析表明在用SjEV孵育的RAW264.7細胞中很容易檢測到SjEV miRNA（miR-125b，miR-61，bantam和miR-277b）（圖3B），表明SjEV miRNA被轉移到受體細胞。
圖3 日本血吸蟲EV miRNA被受體細胞吸收，并與宿主Argonaute結合
04 RNA-seq分析在受體細胞中發現了與SjEVs處理相關的差異表達miRNA
為了檢查受體細胞攝取的SjEV的潛在調節作用，作者使用RNAseq鑒定用日本血吸蟲EV處理的細胞中mRNA的穩態水平的變化。在SjEVs處理的細胞的三個生物學重復中鑒定了2,569個受影響的mRNA，1,211個上調和1,358個下調（圖4A和4B）。
KEGG分析表明改變的mRNA主要參與TNF和Toll樣受體（TLR）信號傳導途徑，細胞因子-細胞因子受體相互作用，Rap1信號傳導途徑和其他信號傳導途徑。為了進一步了解SjEV miRNA貨物在受體細胞中的潛在調節作用，作者選擇了豐富的miR-125b（64.21％的miRNA讀數）和bantam用于進一步分析。
首先使用TargetScan和miRanda來預測這兩種miRNA的假定靶標。這些軟件共同預測了miR-125b的257個的mRNA靶標和bantam的12個的mRNA靶標。然后，選擇了幾個預測的mRNA靶標并使用RT-qPCR證實這些mRNA靶標水平在SjEV處理的細胞中被改變。與RNA-seq結果一致，RT-qPCR在RAW264.7細胞處理的SjEV的獨立實驗中證明了這些mRNA的減少（圖4C）。
圖4 RNA-seq分析SjEVs處理細胞中差異表達的mrna
05 SjEV miR-125b和bantam miRNA功能分析驗證
在miR-125b的預測靶標中，已知蛋白質S1（Pros1）和F11r分別抑制TLR-觸發的炎癥反應并調節免疫細胞功能和細胞因子產生。
為了確定Pros1和F11r mRNA是否可被SjEV miR-125b靶向，將mRNA 3'UTR預測的miRNA結合位點（使用TargetScan和mRanda預測）克隆到熒光素酶報告基因（pGlu-CMV）的3'UTR中。結果表明miR-125b可以下調RAW264.7細胞中相應的Pros1和F11r mRNA靶區域的表達。
為了進一步證明Pros1和F11r下調影響TLR信號傳導，作者設計并優化了有效沉默Pros1（siRNA-425）或F11r（siRNA-716）的siRNA（圖5F）。結果表明用Pros1 siRNA處理RAW247.1細胞可以抑制Pros1導致參與TLR信號傳導的分子的表達增加和細胞培養基中TNF-α濃度增加；而F11r沉默不影響TLR信號傳導和TNF-α濃度。
使用相似的方法，作者證明了SjEVbantam miRNA可以靶向巨噬細胞中的Fam212b，Clmp和Prtg以影響TNF-α的產生。另外，小鼠實驗和流式細胞術分析分析結果還表明SjEV miR-125b和bantam影響巨噬細胞增殖。
圖5 SjEV miR-125b靶向pro1，影響巨噬細胞TLR信號通路
由于單核細胞數量增加和TNF-α濃度升高與感染血吸蟲的小鼠有關，作者還評估了宿主外周血單核細胞水平是否會影響蠕蟲負荷和卵子沉積。實驗結果表明宿主單核細胞數量的減少顯著減少了小鼠的寄生蟲負荷和卵沉積，說明血吸蟲分泌的EV誘導的外周血單核細胞數量增加可能在寄生蟲存活和產卵過程中起關鍵作用。
結論
作者證明從日本血吸蟲（SjEVs）釋放的EV主要由巨噬細胞和其他宿主外周血免疫細胞攝取，并且它們載運的miRNA轉移到受體細胞中。日本血吸蟲EV miR-125b和bantam miRNA攝入宿主細胞增加了巨噬細胞增殖和TNF-α產生，這有助于寄生蟲存活。作者的研究結果揭示了SjEV miRNA在促進血吸蟲寄生中的關鍵作用。
原文索引
Liu J, Zhu L, Wang J, Qiu L, Chen Y, Davis RE, et al. (2019) Schistosoma japonicum extracellular vesicle miRNA cargo regulates host macrophage functions facilitating parasitism. PLoS Pathog 15(6): e1007817.
