2019-06-07
正 文
近期，派森諾生物與中國海洋大學合作，在《Systematic and Applied Microbiology》（影響因子3.899）發表研究論文，通過qPCR和高通量測序實驗揭示厭氧氨氧化細菌在長江口及其鄰近海域沉積物中的群落結構和分布特性，為微生物參與氮循環研究提供了新視角。
研究背景?
大多數人為產生的氮通過河流、地下水和大氣活動被輸送至河口和沿海地區。了解氮的去除以及相關微生物參與氮循環的過程對生態系統的保護至關重要。厭氧氨氧化細菌對海水中氮的去除有著重要影響，而Amx-16S rRNA和hzo基因可作為研究厭氧氨氧化細菌在自然生態系統中群落特征的標志基因。
長江口是長江三角洲前緣的一個大河段，接受長江陸源物質的大量輸入。這條河流對長江口及其鄰近海域的理化性質、環境和生態系統有著很大的影響。對該區域氮循環微生物的研究對生態系統的保護有著重要意義。
研究目的
通過qPCR和高通量測序了解長江口海域厭氧氨氧化細菌的分布和群落結構；
測序方法
測序技術：Roche 454高通量測序平臺
測序模式：厭氧氨氧化細菌16S rRNA基因+功能基因hzo測序
實驗對象：沉積物
實驗設計
自2011年7月至8月，從長江口及其鄰近的東海域收集20份表層沉積物和地層水樣本。沉積物樣本用于分子生物學分析，底層水用于理化性質分析。厭氧氨氧化細菌amx-16S rRNA基因和hzo功能基因用于厭氧氨氧化細菌qPCR和高通量測序分析，反硝化細菌功能基因nirS用于反硝化細菌的qPCR分析。
圖1 長江口及其鄰近海域取樣點分布圖
研究結果
不同取樣點厭氧氨氧化細菌的豐度和多樣性組成譜
? 厭氧氨氧化細菌豐度
amx-16S rRNA基因在不同取樣點的拷貝數從6.73×105到3.81×107 g?1（鮮重）不等，在取樣點S33拷貝數最多，S22拷貝數最少；厭氧氨氧化細菌功能基因hzo在不同取樣點的拷貝數從9.86×106到1.02×108 g?1（鮮重）不等，在S33拷貝數最多，S1拷貝數最少，表明厭氧氨氧化細菌的豐度在長江口及其鄰近海域有著空間差異。厭氧氨氧化細菌在長江口的豐度低于浙江南部沿海地區（圖2a，b）。
圖2 不同取樣點amx-16S rRNA（a）、hzo（b）、nirS（c）的豐度以及反硝化和厭氧氨氧化的比值（d）
? 海洋沉積物中厭氧氨氧化細菌的多樣性和豐富度
amx-16S rRNA基因、功能基因hzo 的高通量測序研究結果表明不同取樣點的厭氧氨氧化細菌多樣性有著空間上的差異，并且由amx-16S rRNA基因表征的厭氧氨氧化細菌在不同取樣點的多樣性大小與功能基因hzo 表征的結果有所差別（表1）。
表1 厭氧氨氧化細菌多樣性特征
系統發育樹分析表明3種已知的厭氧氨氧化菌屬Ca.Scalindua、Ca.Brocadia、Ca. Aestuarianus和某些未知的厭氧氨氧化細菌存在于長江口及鄰近海域（圖3）。
圖3 基于amx-16S rRNA序列的系統發育樹
在綱水平，Planctomycetacia 是各取樣點（S13、S20、S31、S33）的優勢物種（>90%），其余物種為MD2896-B258、Pla3 lineage、Pla4 lineage和Alphaproteobacteria（圖4a）。
在屬水平，Planctomycetales 分類下的菌屬Ca.Scalindua 和Ca.Brocadia 共同存在于不同的取樣點，其中Ca.Scalindua為優勢屬（約90%），其余菌屬uncultured Planctomycetales bacteria、Oceanicella uncultured bacterium、W4 uncultured bacterium和Ca.Brocadia豐度均較低（圖4b）。
Ca.Scalindua屬下的種水平物種中不可培養的厭氧氨氧化細菌占較大比例，而被檢測到的已知物種為anaerobic ammonium-oxidizing planctomycete JMK-2、Ca.Scalindua brodae、Ca.Scalindua sp. enrichment culture clone15L 和 Ca.Scalindua wagneri。其中anaerobic ammonium-oxidizing planctomycete JMK-2 在S20占比較高，而Ca.Scalindua sp. enrichment culture clone 15L在S31占比較高（圖5）。
圖4 amx-16S rRNA基因表征的厭氧氨氧化細菌群落結構
圖5 amx-16S rRNA基因表征的厭氧氨氧化細菌Scalindua種水平的群落結構
NMDS分析表明厭氧氨氧化細菌有著特定的地理分布，其中S20和S30有著相似的群落結構，而其他取樣點群落結構差別較大（圖6）。
圖6 amx-16S rRNA基因表征的厭氧氨氧化細菌NMDS分析
功能基因hzo 高通量測序結果顯示所有序列均屬于不可培養的菌屬，因此對hzo 基因序列構建傳統的系統發育樹，結果表明在各取樣點由hzo 基因表征的優勢菌屬為Ca. Scalindua（圖7）。
圖7 基于hzo 序列的系統發育樹
不同取樣點反硝化細菌的分布
反硝化細菌功能基因nirS在不同取樣點的拷貝數從3.35×107到2.89×109 g?1（鮮重）不等，其中在S32拷貝數最多，S4拷貝數最少。這些結果表明反硝化細菌的豐度在長江口及其鄰近海域有著空間差異。反硝化細菌在長江口和浙江南部沿海地區的豐度高于較低的沿海區域（圖2c）。反硝化細菌的豐度顯著高于厭氧氨氧化細菌（Student’s t test， P < 0.01）。反硝化細菌和厭氧氨氧化細菌的比值在長江口北部高于南部近海區域（圖2d）。此外厭氧氨氧化細菌和反硝化細菌的豐度呈正相關（P<0.05，r=0.447）。
厭氧氨氧化細菌豐度和群落結構與環境變量的關系
斯皮爾曼相關性分析顯示由amx-16S rRNA基因表征的厭氧氨氧化細菌豐度與沉積物中的TOC（P<0.01，r=0.718）和TN（P<0.01，r=0.811）呈正相關，與底層水的NO3?（P < 0.05，r = ?0.464）、NOx?（P < 0.05，r = ?0.472)和PO43?（P < 0.05， r = ?0.506）的濃度呈負相關；
此外由功能基因hzo 表征的厭氧氨氧化細菌豐度與沉積物中的TOC（P<0.01，r=0.699）和TN（P<0.01，r=0.747）呈正相關，與底層水的NO3?（P < 0.05，r = ?0.660）、NOx?（P < 0.05，r = ?0.659)和PO43?（P < 0.05， r = ?0.669）的濃度呈負相關（表2）。
表2 環境因子和厭氧氨氧化細菌豐度的斯皮爾曼相關性分析
RDA分析揭示了厭氧氨氧化細菌豐度和群落結構與環境因子的潛在關系（圖8和9）。沉積物環境因子包括深度、鹽度、溶解無機氮（DIN）、TOC以及NO2?、NO3?、NH4+和PO43?濃度對厭氧氨氧化細菌的群落結構以及細菌與生境的關系有著不同的貢獻。RDA的前兩軸分別解釋沉積物厭氧氨氧化細菌70.5%和2.9%的豐度差異（圖8）。
此外基于amx-16S rRNA基因高通量測序的RDA前兩軸分別解釋了72.8%和23.1%的群落結構差異，基于功能基因hzo高通量測序的RDA前兩軸分別解釋了60.7%個30.3%的群落結構差異（圖9）。
這些結果證明了TOC（F=15.21，P<0.01，499 permutations）與氨氧化細菌的豐度有著顯著的關系，為RDA分析提供了46%的解釋度。
類似地，NO2?濃度對群落結構的影響為RDA分析提供了57%的解釋度。此外厭氧氨氧化細菌的豐度和組成與深度、鹽度、NH4+、DIN 和PO43?濃度有關。
圖8 沉積物厭氧氨氧化細菌豐度和環境因子的RDA分析
圖9 沉積物厭氧氨氧化細菌OUT組成和環境因子的RDA分析
總 結
本文通過qPCR和高通量測序技術為厭氧氨氧化細菌在長江口及其鄰近海域沉積物中的存在、分布和多樣性研究提供了證據。16S rRNA基因和hzo 基因的高通量測序表明Ca. Scalindua 和Ca. Brocadia 存在于所研究區域的沉積物中。
qPCR結果表明反硝化細菌比厭氧氨氧化細菌的豐度更高。相關性分析和RDA分析結果表明沉積物的理化性質對厭氧氨氧化細菌的群落結構有重要影響。
本研究的測序和部分數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
文章索引
Lulu Fu et al. Shifts in the anammox bacterial community structure and abundance in sediments from the Changjiang Estuary and its adjacent area. Systematic and Applied Microbiology 34(2019):383-396
