2019-05-31
文案 微生物組產(chǎn)品線
正文
最近，派森諾生物與福建省農(nóng)業(yè)科學院合作，在《International Journal of Biological Macromolecules》（影響因子3.909）再次發(fā)表論文，以人類結(jié)腸微生物菌群為實驗對象，制作體外發(fā)酵裝置，研究了O-乙酰阿拉伯木聚糖對腸道環(huán)境的影響，并利用高通量測序技術(shù)，探究了在發(fā)酵過程中腸道微生物群落的變化。
研究背景
人體腸道是一個龐大、多樣且動態(tài)變化的微生物棲息地，從飲食中攝取某些特定碳水化合物（如益生元），能有效調(diào)節(jié)人體腸道菌群。這些碳水化合物在腸道中經(jīng)腸道菌群發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸（SCFAs），可降低pH，維護有益的腸道環(huán)境，不過，不同碳水化合物在腸道中的發(fā)酵部位不同，比如，線性和水溶性的低聚糖或多糖會在結(jié)腸近端發(fā)酵，但結(jié)構(gòu)更復雜些的多糖便會在結(jié)腸遠端發(fā)酵，且速度緩慢。
然而，由于蛋白質(zhì)降解過程中產(chǎn)生的氨、聚氨酯和其它不良代謝物的積累，結(jié)腸遠端其實是較易患癌的部位。結(jié)構(gòu)復雜的多糖可作為結(jié)腸遠端SCFAs產(chǎn)生的碳源，并抑制蛋白質(zhì)和脂肪的代謝，減少結(jié)腸的患癌風險，因此，若發(fā)現(xiàn)可在結(jié)腸遠端發(fā)酵的新多糖，則能極大促進結(jié)腸疾病的預防。
不同多糖對人體結(jié)腸菌群的影響不同，比如阿拉伯木聚糖能夠刺激雙歧桿菌的增殖，但目前關(guān)于乙酰化木聚糖對人類菌群的影響還知之甚少。本研究中，作者便利用體外培養(yǎng)發(fā)酵技術(shù)與高通量測序技術(shù)，研究了玉米穗軸木聚糖（CCX）和從竹子碎屑中獲得的具有免疫刺激活性的O-乙酰阿拉伯木聚糖（BSH-1），對結(jié)腸菌群構(gòu)成的發(fā)酵環(huán)境的影響，以探究BSH-1對人結(jié)腸菌群的影響，為結(jié)腸疾病的預防提供理論基礎。
研究內(nèi)容
①研究分別添加了BSH-1和CCX的發(fā)酵系統(tǒng)與未添加任何碳源的發(fā)酵系統(tǒng)中，總碳水化合物、游離單糖、低聚糖、pH、SCFAs和酶活性的變化；
②研究BSH-1和CCX對結(jié)腸微生物群落的影響。
研究目的
研究BSH-1對人結(jié)腸環(huán)境與微生物群落的影響，為結(jié)腸疾病的預防提供理論基礎。
材料與方法
測序技術(shù)：Illumina MiSeq高通量測序平臺
測序模式：微生物組細菌16S rRNA基因V4區(qū)測序
實驗對象：發(fā)酵底物?
實驗設計
接種新鮮人糞便，設置BSH-1與玉米穗軸木聚糖（CCX）的體外發(fā)酵器，將發(fā)酵器置于37℃的厭氧環(huán)境下發(fā)酵，每隔6 h取一次樣本，一部分樣本用于測定總碳水化合物、游離單糖、低聚糖、pH、SCFAs和酶活性，一部分樣本用于微生物組成譜測序。
表1 取樣信息
結(jié) 果
體外發(fā)酵器中的pH值和碳水化合物變化
發(fā)酵過程中，每組樣本的pH值和碳水化合物變化分別如圖1a、1b所示，在整個發(fā)酵過程中，BSH-1組的pH值要低于BLK組，但高于CCX組，即BSH-1或CCX的添加會顯著影響腸道環(huán)境中的pH值。如圖1b所示，發(fā)酵24 h（48 h）后，人體結(jié)腸細菌對BSH-1和CCX的消耗率分別為33.1%（46.1%）和57.2%（73.5%），即人結(jié)腸細菌對BSH-1的消耗率相對于CCX來說較低，這可能是由于CCX的分子量與飽和度更低。
圖1 （a）每組樣本中pH值的變化；（b）發(fā)酵過程中，各組中總碳水化合物的變化
體外發(fā)酵過程中酶活性的變化
通過檢測發(fā)酵系統(tǒng)中乙酰基、阿拉伯糖和木糖的去除率，本研究分析了AcXEs、阿拉伯糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶的酶活性變化。如圖2a所示，BSH-1和CCX中的AcXEs活性在6 h時達到最大值，隨后逐漸降低，而芽孢桿菌也在6 h時大量富集（圖3c），這表明，BSH-1中的O-乙酰基可能會被人結(jié)腸中的芽孢桿菌和擬桿菌消化利用。如圖2b-d所示，BSH-1和CCX中阿拉伯呋喃糖酶活性在6 h時最高，隨后逐漸降低至和BLK組同一水平。另外，BHS-1組中的木聚糖酶活性也隨著發(fā)酵的進行逐漸增高，并在24 h時達到峰值，隨后逐漸降低（圖2c）。BSH-1和CCX中的木糖苷酶則是在發(fā)酵的前12 h內(nèi)活性很低，但隨后逐漸升高，并在48 h時達到最高值。
圖2 發(fā)酵過程中，各發(fā)酵系統(tǒng)中AcXEs、阿拉伯糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶的酶活性變化
體外發(fā)酵過程中游離單糖和寡糖的變化
本實驗的初始發(fā)酵樣本中，BLK組不含游離單糖與寡糖，BSH-1和CCX組中含有少量的游離單糖與寡糖；發(fā)酵12 h后，這兩組樣本中的阿拉伯糖，木糖，木二糖，木三糖，木四糖，木戊糖和木六糖含量都達到了最高水平，隨后逐漸降低，這表明，BSH-1和CCX在發(fā)酵過程中會被酶逐漸水解。
體外發(fā)酵過程中微生物群落的變化
PCA分析結(jié)果顯示（圖3a），T24-BSH-1（T48-BSH-1）和T24-CCX（T48-CCX）的組間距離與T24-BLK（T48-BLK）不同，這表明，發(fā)酵24 h和48 h后，BSH-1和CCX組中的群落組成明顯不同于BLK組。門水平上各樣本中的結(jié)腸微生物細菌組成如圖3b所示，所有樣本中的微生物群落主要都包含厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、梭桿菌和放線菌。其中，BSH-1和CCX組中的擬桿菌與放線菌在發(fā)酵24 h后顯著增加，而梭桿菌顯著減少。基于相對豐度前50位屬的熱圖（圖3c）顯示，相較于BLK組，BSH-1和CCX組中的多個屬在發(fā)酵過程中發(fā)生了顯著變化。另外，發(fā)酵24 h后，BSH-1中的擬桿菌與Prevotella_7顯著增加，這表明，乙酰化木聚糖可能會被這兩種菌利用。
圖3 （a）各樣本微生物群落的PCA分析；（b）門水平上個樣本中結(jié)腸微生物細菌組成柱狀圖；（c）基于相對豐度前50位屬的熱圖
發(fā)酵過程中SCFAs的產(chǎn)量
如圖4所示，在發(fā)酵階段，BSH-1組中的乙酸、丙酸和正丁酸濃度顯著高于BLK組，不過，相較于CCX組，雖然BSH-1組中的乙酰化水平較高，但產(chǎn)生的乙酸卻并不比CCX組多，同時，BSH-1中的n-丁酸含量顯著高于CCX組，這可能是由于乙酸在發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化為了n-丁酸。另外，在發(fā)酵過程中所有分組中的戊酸濃度均一直很低。總的來說，發(fā)酵過程中，BSH-1和CCX組中的SCFAs均顯著高于BLK組。
圖4 發(fā)酵過程中短鏈脂肪酸的濃度變化
總 結(jié)
本文利用體外培養(yǎng)發(fā)酵技術(shù)與高通量測序技術(shù)，研究了玉米穗軸木聚糖（CCX）和從竹子中獲得的免疫刺激活性O-乙酰阿拉伯木聚糖（BSH-1），對結(jié)腸菌群構(gòu)成的發(fā)酵環(huán)境以及人結(jié)腸菌群的影響，并得到以下結(jié)論：
①BSH-1能夠通過抑制有害菌，促進有益菌生長，來調(diào)節(jié)人類結(jié)腸微生物群落的組成；
②BSH-1顯著促進了乙酸、丙酸和n-丁酸等短鏈脂肪酸的產(chǎn)生；
③發(fā)酵48小時后，BSH-1中n-丁酸的濃度相較于對照組增加了2.41倍，同時也遠高于CCX組；
④在發(fā)酵過程中，乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶的活性有所增強。?
本研究的測序和部分數(shù)據(jù)分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
文章索引
Huang J, Wang Q, Xu Q, et al. In vitro fermentation of O?acetyl?arabinoxylan from bamboo shavings by human colonic microbiota[J]. International journal of biological macromolecules, 2019, 125: 27-34.
