近期，派森諾生物與南京中醫(yī)藥大學(xué)合作，在《Frontiers in Microbiology》（影響因子4.019）發(fā)表研究論文，通過(guò)為期8周的糖尿病模型大鼠糞便微生物組多樣性組成譜測(cè)序，實(shí)時(shí)展現(xiàn)了大鼠糖尿病發(fā)展進(jìn)程中的腸道微生物組變化，為深刻認(rèn)識(shí)微生物組在代謝疾病中的作用以及利用微生物干預(yù)治療糖尿病提供了研究基礎(chǔ)與治療策略。
Ⅱ型糖尿病（T2DM）是目前較為常見(jiàn)的代謝疾病，大量研究表明糖尿病患者的糞便微生物群落結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生顯著變化。在T2DM研究領(lǐng)域，微生物是否可以用于減輕糖尿病病癥仍是一個(gè)亟待解決的重要問(wèn)題。由于人類倫理和樣本數(shù)量的限制，通常采用小型動(dòng)物模型對(duì)糖尿病動(dòng)物糞便微生物進(jìn)行研究。ZDF大鼠由于瘦素受體基因突變，能夠誘發(fā)肥胖和胰島素抵抗，并發(fā)展為T2DM，是T2DM研究的重要模型。通過(guò)ZDF大鼠研究模型的建立，可以更好地了解Ⅱ型糖尿病發(fā)展進(jìn)程中腸道微生物組的變化以及微生物對(duì)糖尿病產(chǎn)生的影響。
? 觀察Ⅱ型糖尿病發(fā)展進(jìn)程中的糞便微生物組動(dòng)態(tài)變化；
? 為糖尿病治療提供有效的微生物干預(yù)策略。
測(cè)序技術(shù)：Illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)
測(cè)序模式：微生物組細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)測(cè)序
實(shí)驗(yàn)對(duì)象：大鼠糞便
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：本研究使用4只雄性ZDF大鼠（表現(xiàn)為高胰島素血癥和高血糖），喂養(yǎng)Purina 5008食物8周（第8周至15周），共收集32份糞便樣本，進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序，以反映大鼠糖尿病發(fā)展期間的糞便微生物組成和變化；期間實(shí)時(shí)觀察大鼠的體重、攝食量、飲水量、直腸溫度、RBG（隨機(jī)血糖）和OGTT（口服葡萄糖耐量試驗(yàn)）等生理特性，并采用非參數(shù)斯皮爾曼關(guān)聯(lián)分析，評(píng)估ZDF大鼠生理特性與微生物的關(guān)系。
與8周齡相比，ZDF大鼠在9到15周齡的體重顯著增加（圖1A）。從8到15周齡，ZDF大鼠的食物和水?dāng)z入量逐漸增加（圖1B，C），直腸溫度保持穩(wěn)定（圖1D）。8周齡ZDF大鼠RBG水平達(dá)到糖尿病狀態(tài)（圖1E）。在第14周進(jìn)行OGTT實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示血糖濃度在30 min達(dá)到最高水平，然后逐漸下降，但直至120 min仍不能恢復(fù)至正常水平（圖1F）。以上結(jié)果表明ZDF大鼠表現(xiàn)為糖尿病病理特征，其病情隨著年齡的增長(zhǎng)而加重、葡萄糖耐量受損、胰島素敏感性降低。
圖1 ZDF大鼠從8到15周齡的生理特性
二型糖尿病（T2DM）發(fā)展過(guò)程中微生物組多樣性的動(dòng)態(tài)變化
T2DM發(fā)展過(guò)程中Shannon和Simpson指數(shù)有著一致的變化，通過(guò)Simpson指數(shù)（SDI）分析可以發(fā)現(xiàn)，ZDF大鼠從9到12周齡SDI值逐漸增大，于12周齡達(dá)到最大值，13-15周齡有輕微的下降（圖2）。聚類熱圖展現(xiàn)了不同周齡大鼠糞便中的主要菌屬，各階段不同的微生物菌屬反映了微生物群落的多樣性和動(dòng)態(tài)變化（圖3）。
圖2 T2DM發(fā)展期間32份糞便樣本Simpson指數(shù)的變化
圖3 大鼠在各周的屬水平微生物豐度熱圖
ZDF大鼠糖尿病期間的核心微生物群落鑒定
加權(quán)UniFrac距離箱線圖顯示組間UniFrac距離大于組內(nèi)UniFrac距離（圖4）。門水平分類學(xué)組成分析表明5-15周齡ADF大鼠90%的微生物群落為Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria 和Proteobacteria，其中相對(duì)豐度最高的為Firmicutes（圖5）。在8-9周齡，優(yōu)勢(shì)微生物為Firmicutes 和Bacteroidetes；從10-15周齡，Actinobacteria 相對(duì)豐度逐漸增加；在15周齡，Proteobacteria 顯著增加。不同門的相對(duì)豐度在各周齡各不相同，表明ZDF大鼠有著動(dòng)態(tài)的微生態(tài)系統(tǒng)。
圖4 加權(quán)UniFrac距離箱線圖
圖5 門水平物種組成和相對(duì)豐度圖
ZDF大鼠糞便微生物豐度的階段性特點(diǎn)
加權(quán)UniFrac距離聚類熱圖顯示8-10周齡與11-13周齡樣本形成了兩個(gè)明顯不同的簇集（圖6）。有些樣本與同一組的樣本聚類在一起（如12周齡），有些樣本與相鄰周齡的樣本聚類在一起（如11-12周齡、13-14周齡）。
基于加權(quán)UniFrac距離的PCoA分析顯示，8、9、10周齡樣本沿著PC3軸聚集在一起，其余樣本（11-15周齡）聚集在一起（圖7）。共有和特有OTU花瓣圖表明從8周齡到15周齡，有306個(gè)共有OTU，并且各周齡都有特有的OTU（圖8），主要特有OTU屬于Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria 和Proteobacteria。
圖6 加權(quán)UniFrac距離聚類熱圖
圖7 糖尿病不同發(fā)展階段的糞便微生物組組成結(jié)構(gòu)
圖8 糖尿病不同發(fā)展階段的共有和特有的OTU
ZDF大鼠微生物物種組成隨年齡增長(zhǎng)和疾病發(fā)展的變化
16個(gè)主要菌屬的柱狀圖顯示Lactobacillus 是ZDF大鼠糖尿病發(fā)展過(guò)程中豐度最高的屬，Turicibacter 的相對(duì)豐度從8周齡到15周齡逐漸下降，Allobaculum 的相對(duì)豐度從11周齡到15周齡逐漸增加（圖9）。差異分析（P<0.05）展示了隨時(shí)間變化差異最大的15個(gè)屬（圖10），這些微生物的豐度波動(dòng)表明在糖尿病的發(fā)展過(guò)程中微生物的群落結(jié)構(gòu)是動(dòng)態(tài)的。
圖9 糖尿病發(fā)展不同階段的微生物群落結(jié)構(gòu)變化
圖10 糖尿病不同發(fā)展階段豐度變化最大的15個(gè)屬
ZDF大鼠的生理特性與失調(diào)的菌群有關(guān)
Firmicutes/Bacteroidetes（F/B）比值被廣泛用于評(píng)價(jià)菌群失調(diào)。斯皮爾曼相關(guān)性分析顯示F/B與大鼠年齡呈負(fù)相關(guān)（R=-0.35，P=0.04）（圖11A），而F/B與體重、RBG、食物攝入量、飲水量和直腸溫度等生理指標(biāo)并沒(méi)有顯著相關(guān)性（圖11B-F）。RBG與Lactobacillus（R = -0.42， P = 0.02）和Turicibacter（R =- 0.48，P = 0.004）的相對(duì)豐度呈負(fù)相關(guān)，與Ruminococcus（R = 0.45，P = 0.009）和Allobaculum（R = 0.37， P = 0.03）的相對(duì)豐度呈正相關(guān)（圖12C，D），與SDI呈正相關(guān)（R = 0.44、P = 0.01）（圖12E）。RBG與Bacteroides、Akkermansia 和Bifidobacterium 并沒(méi)有顯著性關(guān)系（圖12F-H）。
圖11 ZDF大鼠F/B比值與生理特性的相關(guān)性
圖12 隨機(jī)血糖水平和微生物群落變化以及Simpson指數(shù)之間的相關(guān)性
本研究檢測(cè)了8周齡到15周齡的ZDF大鼠在糖尿病發(fā)展進(jìn)程中的糞便微生物群落結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果表明糞便微生物結(jié)構(gòu)隨著糖尿病的發(fā)展有著高度的動(dòng)態(tài)性和顯著的變化。
糞便微生物的時(shí)間依賴性變化為研究Lactobacillus、Turicibacter、Bifidobacterium、Allobaculum、Ruminococcus 和 Akkermansia 在糖尿病發(fā)展進(jìn)程中的作用提供了支持。
本研究的測(cè)序和部分?jǐn)?shù)據(jù)分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
Zhou et al. Dynamic Development of Fecal Microbiome During the Progression of Diabetes Mellitus in Zucker Diabetic Fatty Rats. Frontiers in Microbiology 10(2019):232.
