2019-04-25
正 文
最近，派森諾生物與上海地理研究所合作，在《Chemosphere》（影響因子4.427）再次發表論文，將植物與細菌相結合，利用微生物多樣性組成譜測序，探究了由鳳眼蓮（Eichhornia crassipes）和細菌組成的植物——細菌結合體系對土壤中原油污染的治理效果與作用機制。
研究背景
近年來，原油污染因其對環境的強破壞性而引起了公眾的注意，急需發展環保的技術對其進行治理。之前的研究證明，伯克霍爾德氏菌目（Burkholderiales）細菌對原油降解有一定的作用，但它對土壤中原油的降解能力還知之甚少。
鳳眼蓮生長速度極快，是一種非常容易獲得的自然材料，且有著較高毛細作用與疏水表面，能夠吸附污染物，因此，本研究利用鳳眼蓮的干粉作為細胞載體，與微生物相結合，制作鳳眼蓮干粉——固定化細菌聯合體系，探究該體系對土壤中原油的去除效果，以及在生物治理的過程中，土壤細菌群落的變化，并揭示土壤中的各種因素與細菌群落組成的關系，以期深入理解生物修復系統中細菌的作用機制。
研究內容與目的
①探究鳳眼蓮干粉——固定化細菌聯合體系對土壤中原油的去除效果；
②研究在利用該體系對原油污染進行生物治理的過程中，土壤中細菌群落的變化；
③揭示土壤中的各種因素與細菌群落組成的關系。
材料與方法
測序技術：Illumina MiSeq高通量測序平臺
測序模式：微生物組細菌16S rRNA基因V4區測序
實驗對象：土壤
實驗設計
①制備實驗材料：受原油污染的土壤、鳳眼蓮干粉、細菌懸液等；
③在塑料壺中建立實驗系統，并設置四個處理組（表1）；
④20℃下存放30 d，每10 d混合一次以保證足夠的氧氣，并添加蒸餾水使土壤含水量維持在20%的水平上；
⑤30 d后，取部分土壤，凍干過篩，用于測定總石油烴（TPH）、土壤理化性質，并分析原油中正構烷烴的變化，其余土壤則存放至-20℃下用于測定土壤中微生物的細菌群落結構（Illumina高通量測序技術）與活性（FDA法）。
表1 各實驗系統的處理信息
結果與討論
? 石油烴的去除效果
石油烴（TPH）的去除率對生物治理的效果有指示作用。如圖1所示，生物修復30天后，CK、E、B和EB這四個處理組的TPH去除率分別為34.7%、37.0%、36.0%和51.7%，可以發現，這四個處理組的土壤中，CK、E和B這三組的TPH去除率并沒有顯著差異，但EB組的TPH去除率明顯高于其它組。
正構烷烴是原油的主要構成物質，根據色譜峰的區域，計算了相對于實驗開始時，30天后土壤中剩余正構烷烴的比率（圖1b）。色譜圖顯示，除了E組外，其余處理中正構烷烴的相對含量都隨碳數的增加而降低；EB處理還對C11-C25正構烷烴有更好的去除效果，這表明，鳳眼蓮干粉——固定化細菌聯合體系確實對石油烴的去除有增強作用。
圖1 生物修復30天后，TPH的去除率，以及相對于實驗開始時，剩余正構烷烴的百分比
? 土壤中細菌群落和微生物活性的改變
研究將CK組土壤中的細菌群落作為原始微生物群落，以分析各處理組中微生物群落的變化。各處理中微生物群落的Shannon多樣性指數與Chao1豐富度指數如圖2a所示，E和B組的多樣性指數顯著低于CK組，但EB組卻和CK組無明顯差異；這表明，鳳眼蓮干粉或細菌懸液的單獨添加都會降低土壤中細菌群落的多樣性與豐富度，但兩者同時添加卻能防止細菌多樣性的損失。
伯克霍爾德氏菌在B（9.57%）與EB（8.43%）中的相對豐度明顯高于其在CK（3.93%）與E（4.63%）中的相對豐度。除了伯克霍爾德氏菌之外的其余細菌主要歸屬于14個目，其中放線菌目在所有處理中都占最優勢的地位（24.4%~55%）。噬纖維菌目（1.5%）與根瘤菌目（5.5%）在CK中的相對豐度很低，但在添加了鳳眼蓮干粉的E組中，它們的相對豐度分別增加到了5%與15.4%，相似的趨勢在EB中也有出現，這表明，鳳眼蓮干粉的添加能夠刺激纖維菌目與根瘤菌目這兩類菌的生長。
另外，關聯網絡分析顯示（圖2c），纖維菌目與根瘤菌目之間還存在顯著的正相關性，屬水平上的熱圖分析顯示（圖3），這四個處理的優勢細菌組成明顯不同，其中，伯克霍爾德氏菌在EB中豐度最高，而在之前的研究中，一種歸屬于伯克霍爾德氏菌目的細菌被認為對原油有很好的降解作用。
圖2 各土壤樣本中的多樣性指數（a）；目水平上的細菌組成（b）；菌群間的關聯網絡分析（c）
圖3 屬水平上，不同處理土壤中豐度前50位細菌的聚類熱圖
土壤中微生物活性的測定結果如圖4所示，不同處理中的微生物活性差異很大，相對于CK來說，B處理（只添加細菌懸液）中的微生物活性受到了抑制，即原生微生物與接種微生物之間可能存在競爭的關系，而添加了鳳眼蓮干粉的E與EB中，微生物的活性顯著增加。
圖4 生物修復30天后，不同處理的土壤中微生物活性的測定
? 土壤特性與細菌群落的關系
結合土壤理化因子（pH、OC、TN和TP）（表2）與細菌群落的RDA分析（圖5）顯示，EB和CK中的細菌群落在Axis 1或Axis 2中都明顯被分開，即添加鳳眼蓮干粉與細菌懸液后的土壤中，微生物群落發生了明顯的變化。噬纖維菌目與根瘤菌目豐度高的E組，與TOC和TN密切相關；伯克霍爾德氏菌目豐度高的EB組和放線菌豐度高的CK組則與TP密切相關。
生物修復30天后，不同處理土壤中的理化因子情況如表2所示，不同土壤中的pH值變化較小，在7.4至7.9之間；TOC和TN在E中最高。相應的，鳳眼蓮干粉與細菌懸液對土壤中原油的去除作用可能會遵循如下假設：
首先，鳳眼蓮干粉的添加，能增加土壤中的各種營養物質（尤其是TOC和TN）；隨后，增加了營養物質的土壤為噬纖維菌目和根瘤菌目等化能有機營養型細菌提供了適宜的生長條件；最后，土壤中的總微生物活性增加，且伯克霍爾德氏菌目菌逐漸增殖，土壤中原油的去除率也隨之增加。
表2 生物修復30天后，各土壤中的理化因子
圖5 土壤細菌群落與理化因子的RDA分析
總 結
本文結合利用高通量測序技術，探究了由鳳眼蓮（Eichhornia crassipes）和細菌組成的植物——細菌結合體系對土壤中原油污染的治理效果與作用機制，并得到以下結論：
①鳳眼蓮干粉——固定化細菌聯合體系能顯著增強土壤中原油的去除效果；
②鳳眼蓮干粉在土壤中的分解增加了土壤中的營養物質，為土壤中微生物的生長創造了良好的環境，誘導了微生物群落結構的改變，噬纖維菌目和根瘤菌目的相對豐度增加，能降解原油的Burkholderia sp.也因此能在土壤中順利增殖。
本研究的測序和部分數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
文章索引
Tao K, Zhang X, Chen X, et al. Response of soil bacterial community to bioaugmentation with a plant residue-immobilized bacterial consortium for crude oil removal[J]. Chemosphere, 2019, 222: 831-838.
