2019-04-20
近日，派森諾生物與中科院植物生理生態研究所巫永睿研究組合作，在The Plant Cell發表了題為Maize VKS1 Regulates Mitosis and Cytokinesis during Early Endosperm Development的研究論文。該研究利用BSA的方法首次克隆和解析了馬達驅動蛋白在玉米早期胚乳發育過程中的關鍵作用，揭示了早期胚乳細胞數目增殖決定最終籽粒大小的重要分子機理。
玉米胚乳早期發育是籽粒發育的一個重要階段，伴隨著快速而活躍的細胞分裂過程，短時間內形成大量的胚乳細胞，是決定玉米籽粒大小和產量的關鍵因素。
材料與方法
材 料
（1）BSA研究材料：突變體vks1（小粒）與A619（WT）回交6代，自交2代。群體BC6F2的子代突變體、正常的子代各極端表型約100個樣本，構建混池；
（2）圖位克隆材料：突變體vks1與自交系B73雜交，構建的BC1F1群體；
（3）RT-PCR材料：A619和vks1的籽粒發育時期0-24天的胚乳。
方 法
（1）混合分組分析法：BSA定位；
（2）圖位克隆；
（3）RNA原位雜交、亞細胞定位、免疫熒光分析。
研究結果?
利用BSA定位小粒突變基因
小粒突變體和正常籽粒各取約100株構建混池，與親本A619分別建庫測序，進行BSA定位分析。采用bwa軟件的默認參數與參考基因組比對，GATK軟件call SNP，過濾掉測序深度小于5x的reads。采用滑窗法（4Mb的窗口，200Kb的步長）計算突變池、野生池的SNP-index。通過計算突變池與野生池的SNP-index的差值Δ (SNP index)，將目標性狀定位到7號染色體的端粒附近（圖1）。
該區間內有64個候選基因，其中只有1個基因（Zm00001d018624）發生了非同義突變。進一步對該基因進行一代測序驗證，證實該基因第8個外顯子發生點突變，使密碼子CGA變成TGA，導致翻譯提前終止，基因的轉錄水平大幅度降低。作者將該基因命名為vks1。
圖1 突變體的BSA定位結果
A圖：子代混池的SNP-index在7號染色體上的的分布，從上至下依次為：突變混池的SNP-index，野生混池的SNP-index和二者的差值；B圖：BSA定位區間內，Zm00001d018624 基因的結構示意圖和在兩個混池之間的測序序列分布圖。
利用新的群體進一步確認候選基因
突變體與自交系B73雜交后構建BC1F1群體用于進一步確認候選基因。利用傳統的圖位克隆的方法，將候選區間縮小到了InDel8450和InDel5839標記之間（圖2）。基于B73的參考基因組，這兩個標記之間有7個基因被注。突變體的表型與純合的TGA突變緊密連鎖，正常的籽粒在該位點是雜合的，這也證實了基因Zm00001d018624 與突變表型是關聯的。
圖2 BC1F1群體vks1 的精細定位
左圖：BC1F1群體定位的目標區間的分子標記在7號染色體上的物理位置；右圖：BC1F1群體連鎖分析，綠色三角形表示的正常種子的Zm00001d018624基因型為雜合，而突變種子的基因型為純合。
進一步通過玉米的EMS誘變的數據庫（MEMD）和玉米遺傳合作中心（MGCSC）進行玉米的等位基因的反向基因篩選，來驗證小粒的表型與Zm00001d018624 相關聯。發現Zm00001d018624 的3種突變類型的突變體的種子與對應的野生型相比，均表現為小粒。
圖3 vks1 基因結構與突變等位基因的示意圖
紅色矩形和黑色線分別表示外顯子和內含子。填充三角形表示vks1-1、vks1-2、vks1-4至6等5個等位基因突變位點，空心三角形表示Mu插入的vks1-3等位基因。
另外，CRISPR/Cas9轉基因互補實驗的結果驗了Zm00001d018624 基因變異導致了小粒突變表型。
vks1 基因的功能研究
通過表達實驗，發現vks1 在籽粒發育的早期（授粉后2和3天）特異性高表達，并且在雙受精后表達量顯著增加，在2 DAP表達量最高，之后降低。通過原位雜交實驗，發現2 DAP時，vks1 在多核體細胞中表達；3 DAP時，胚乳急劇細胞化。并且vks1 表現出胚乳的特異性表達，在母體組織（果皮和珠心）中未檢測到表達。
圖4 vks1 的表達量以及種子中2 DAP和3 DAP的RNA原位雜交分析
左上圖：不同發育時期，vks1 的基因表達量；左下圖：A619和vks1-1種子、B73和vks1-2種子中vks1 的免疫印跡分析；右圖：vks1 在種子中2DAP、3 DAP的RNA原位雜交結果。
進一步構建瞬時表達載體，發現VKS1FL-GFP包含定位于皮質MTs和細胞核的整個VKS1 蛋白。通過免疫熒光方法觀察到馬達驅動蛋白VKS1 與有絲分裂過程中的微管共定位在一起，而突變體由于缺少VKS1 蛋白導致微管系統紊亂。
圖5 VKS1FL-GFP的亞細胞定位
最后，在前面實驗結果的基礎上，作者提出了vks1 基因發揮功能的模型，來解釋突變體籽粒大小不一致的現象。由于早期細胞分裂是一個快速而動態的過程，而每粒種子在這兩個快速連續的過程中受到的影響程度不同，缺失vks1 后，重者則籽粒大部分早期胚乳細胞都是異常的，而輕者則只有少數細胞異常，早期胚乳不同細胞數目的異常導致細胞數目減少的程度不同，最終形成變異的籽粒大小。
圖6 vks1 功能和籽粒表型變異的模型
總 結
BSA分析作為一種定位的方法，能夠快速定位到控制表型的候選基因，大大縮短了實驗周期。根據定位結果，對候選基因的功能進行進一步研究，是高分文章的必選哦。
本研究的BSA測序和分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
圖7 第四屆全國玉米生物學學術研討會現場圖，文章第一作者黃永財在大會做報告并致謝派森諾
參考文獻
Huang Yongcai,Wang Haihai,Huang, Xing et al. Maize VKS1 Regulates Mitosis and Cytokinesis during Early Endosperm Development[J] .Plant Cell, 2019, DOI: https://doi.org/10.1105/tpc.18.00966.
