2019-03-28
文案 | 微生物組產品線
最近，派森諾生物與復旦大學合作，在《Journal of Hazardous Materials》（影響因子6.434）再次發表論文，結合菌群多樣性組成譜測序、甲基化檢測、qPCR等多種技術，探究了由小球藻（Chlorella vulgaris）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）組成的藻類—細菌共生體系對城市污水的治理的影響。
研究背景
現如今，都市中的城市污水污染問題嚴重影響了城市居民的用水安全，亟待解決。并且，在治理城市污水污染時，不僅需要有效減少水體中有機物、化學需氧量（COD）和難以在自然水環境中降解的污染物的含量，還需要保證添加到城市污水中的有機物能正常存在，且不破壞水體的原生生態結構與多樣性。新型的生物處理法便能達到這些目的。
小球藻是一種生長速度快、世代短的藻類，能夠適應惡劣的環境條件，并吸收廢水中的氮、磷，在污水治理上很有潛力。在這些年里，人們也做了許多利用藻類處理污水的研究，并且發現，去除污水中營養與能量的同時，能夠獲得高水平的生物能。若將藻類與細菌結合起來，或許能組成一種新型污水凈化系統。
因此，本文結合小球藻與地衣芽孢桿菌，建立了藻類—細菌共生體系，以作為一種污水凈化系統，并探究了該系統對不同環境下的城市污水的凈化效果。
研究內容
①藻類—細菌共生體系在城市污水處理中，對TN、NH3-N、PO43--P、COD和DOM等物質，以及難降解的類蛋白物質的去除效果；
②藻類—細菌共生體系對脅迫環境的適應性（DNA甲基化檢測）；
③藻類與細菌在不同培養條件下的動態比例和基因的動態變化；
④不同處理條件下各類水體中的微生物群落變化。
研究目的
揭示由小球藻和地衣芽孢桿菌組成的藻類—細菌共生體系的城市污水治理效果。
材料與方法
測序技術：Illumina MiSeq高通量測序平臺
測序模式：微生物組細菌16S rRNA基因V3-V4區測序
實驗對象：藻類—細菌共生體系中的水體樣本
? 實驗設計
①水樣采集與預處理：在典型污染河流——虬江河的七個不同地點采集新鮮水樣→混勻→檢測水質指標→用0.22 μm的濾膜，過濾水樣，以去除固體；
②單獨培養藻類與細菌，以獲得實驗材料；
③將培養得到的藻類與細菌一起轉移到裝有300 mL新鮮城市廢水的500 mL錐形瓶中，模擬12 h/12 h的光暗循環，并檢測每個實驗系統中的溫度與pH值（表1），本實驗中水樣的相關信息如表2所示；
④在無菌環境中設立實驗系統（圖1）；
⑤檢測水樣中的理化性質、熒光信息；
⑥微生物多樣性組成譜測序，檢測水體中的微生物多樣性與群落結構：
⑦qPCR檢測細菌-藻類基因的動態變化；
⑧檢測藻類—細菌共生系統中整體的微生物核DNA甲基化水平。
表1：各實驗系統的處理信息
表2：實驗所用水樣相關信息
圖1：藻類—細菌共生系統示意圖
結果與討論
? 城市污水中水藻—細菌共生體系的形態分析
不同處理條件下，培養在城市污水中的藻類—細菌共生體系的CLSM與DIC圖像如圖2所示。如圖2B1-3所示，培養在28℃，pH 7.14條件下的藻類—細菌共生體系，附著在藻類表面的細菌很豐富，因此其細胞壁表面輪廓模糊，且形狀為圓形；而將共生體系培養在逆境中時，其形狀和特征都發生了改變，比如，在低溫、低pH條件下培養的共生體系（圖2C1-3，D1-3，E1-3），藻類細胞壁表面便沒有明顯的細菌附著現象，形狀也變為了橢圓形，以更好的在逆境中生存。即藻類—細菌共生體系能夠在28℃，pH 7.14的條件下正常生存，但是低溫與低pH的條件會對共生體系的生長有抑制作用。
圖2：藻類—細菌共生體系的CLSM圖像（A1，A2，A3為只在城市廢水中培養了小球藻的樣本；B1，B2，B3為樣本T2；C1，C2，C3為樣本T4；D1，D2，D3為樣本T3；E1，E2，E3為樣本T5）
? 水質分析
在28℃，pH 7.14的條件下（C4），T、NH3-N、PO43--P和COD的去除率分別是88.82%、84.98%、84.87%和82.25%。各處理條件下，污水中的養分去除趨勢如圖3所示，可以發現，相較于只培養了藻類的處理組（C0），有藻類—細菌共生體系的處理組中的COD與營養物去除效果更好。
圖3：不同處理條件下，城市廢水中T、NH3-N、PO43--P和COD的濃度變化
? DOM的去除
DOM是一類含有氧、氮、硫官能團的芳香族和脂肪族非均質有機化合物，會影響廢水處理的過程中的一些生化過程、顆粒穩定性、顆粒運輸，以及金屬絡合作用。本文以HIX表征DOM的腐殖化程度，以BIX表征不同來源的DOM對其原位生物活性的貢獻，HIX的值越高代表DOM的腐殖化程度越高，BIX高則表示DOM大部分來源于水體內部的內生微生物，BIX低則說明DOM主要來源于陸源或外源釋放物。
本研究中，HIX和BIX分別在0.21 - 0.34和0.52 - 0.76之間，這表明城市污水中的DOM主要來源于污水排放，并非原位微生物。
如圖4所示，T2樣本中類蛋白物質的去除率顯著高于除T0以外的其余樣本，高達56.4%。這表明，藻類—細菌共生體系對類蛋白物質的有效去除具有較大影響。另外，可以發現，在低溫、低pH的培養條件下，藻類—細菌共生體系的生長受到了限制，類蛋白物質的有效去除率也有了相應的減少（圖4中的T3和T5）。
圖4：不同處理條件下廢水樣品的熒光光譜
? 不同培養條件對水體中菌群組成多樣性的影響
高通量測序結果顯示，所有樣本中微生物的豐富度與均勻度都較高（圖5a），值得注意的是，沒有經過藻類—細菌共生體系處理的水樣，微生物群落多樣性與均勻度在五個樣本中雖然是最高的，但是水質檢測顯示，該樣本中的TN、NH3-N和PO43--P都非常高。而正常環境條件下（28℃，pH 7.14）培養了藻類—細菌共生體系的水樣，在最后一個實驗階段的水質要好于未經處理的水樣。
這表明，在適宜的條件下，藻類—細菌共生體系的存在并沒有干擾城市污水中原本的微生物群落多樣性。
各樣本的序列信息與OTU指數如表3所示，T1與T2中的Chao1指數較高，且T2中的Shannon多樣性指數要高于T3、T4和T3，表明低溫低pH等脅迫條件會降低微生物群落中的物種多樣性。
在門水平上，T4樣本中主要以厚壁菌門為主，且相對豐度高達80%，導致T4樣本中的微生物多樣性顯著降低，而另外四個樣本則主要以變形菌門為主（圖5b），同時，T1樣本中的藍藻與放線菌豐度也很高。相較于有藻類—細菌共生體系的樣本來說，沒有藻類—細菌共生體系的樣本中有著更多的藍藻與放線菌，這表明，藻類—細菌共生體系能抑制污水中藍藻與放線菌的生長。另外，相較于溫度，pH對藻類—細菌共生體系生長的影響更大。
除此之外，屬水平上的雙向聚類熱圖（圖5c）顯示，這五個樣本中的優勢菌群各不相同，即藻類—細菌共生體系的存在會顯著改變城市污水中微生物的群落結構。
表3：各樣本的有效序列數、OTU數與多樣性指數
圖5：不同條件下各污水樣本中的微生物豐度累積曲線（a），門水平上的物種組成柱狀圖（b），以及屬水平上的優勢物種雙向聚類熱圖（c）
? 細菌與藻類的動態基因拷貝率
qPCR結果顯示，培養了藻類—細菌共生體系的污水樣本中，不同處理條件下水樣中微生物的動態基因拷貝率顯著不同，在T2中，細菌—藻類的基因拷貝率在前六天呈逐漸升高的趨勢，并在第六天達到了峰值后開始逐漸降低，另外，T2中的細菌—藻類基因拷貝率也明顯低于T4樣本。T3和T5中的基因拷貝率非常低，且沒有波動，就和沒有培養藻類—細菌共生體系的樣本一樣（圖6a）。
? 藻類—細菌共生體系整體的核DNA甲基化水平
通過甲基化酶ELISA檢測發現，樣本T1、T2和T3中的DNA甲基化（5-mC）水平分別為2.92%、7.8%和3.71%（圖6b），這表明，未培養藻類—細菌共生體系的系統對脅迫環境的適應性更弱，而在合適的條件中培養的藻類—細菌體系對環境則有很強的適應性，但隨著培養條件的嚴苛，其適應性也會相應降低。
圖6：熒光定量PCR和DNA甲基化檢測分析
總 結
本文結合菌群多樣性組成譜測序、甲基化檢測、qPCR等多種技術，探究了由小球藻和地衣芽孢桿菌組成的藻類—細菌共生體系對城市污水的治理的影響，并得到以下結論：
① C. vulgaris—B. licheniformis的共生體系不僅對城市污水中的TN、NH3-N、PO43--P和COD有較好的去除效果，還能有效降解難以在自然環境中降解的類蛋白物質；
② 藻類—細菌共生體系在自然狀態下的城市污水中能正常存活并對低溫、低pH的脅迫環境條件有一定的抗逆性；
③ 藻類—細菌共生體系不僅不會減少自然狀態下城市污水中微生物群落的多樣性，還能使微生物的群落結構更穩定。
本研究的測序和數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
文章索引
Xiyan Ji, Huimin Li, Jibiao Zhang, Hexige Saiyin, Zheng Zheng. 2019. The collaborative effect of Chlorella vulgaris-Bacillus licheniformis consortia on the treatment of municipal water. Journal of Hazardous Materials. 365:483-493.
