2019-02-15
文案 | 微生物基因組產品部
正 文
近期，派森諾生物與上海海洋大學合作，在《Frontiers in Microbiology》（影響因子4.019）發表論文，通過對大腸桿菌EC11菌株的全基因組研究，發現該菌株含有屬于Incx4群的抗性質粒pEC11b，對粘菌耐藥的mcr-1 基因正是被插入到pEC11b的2.6-kb mcr-1-pap2盒中。檢測mcr 基因有助于跟蹤、減緩中國畜牧業抗生素耐藥性的出現。
研究背景
抗菌素耐藥性正成為公共衛生面臨的一大挑戰。粘菌素（多粘菌素E）是一類陽離子多肽類抗生素，是治療嚴重細菌感染的最后一道防線。尤其是用于治療產生ESBL和CRE感染。
粘菌素耐藥性被被認為是細菌的固有特性。然而，最近發現的攜帶mcr-1 基因的大腸桿菌，證實了水平基因轉移（HGT）對粘菌素抗性的傳播。mcr-1 基因的傳播已經很明顯，并有文獻記載。
目前，研究人員已經發現了5個類似的基因，從mcr-1到mcr-5，它們都有一系列的mcr基因變體，如mcr-1.2、mcr-1.3、mcr-1.12。這些mcr基因已在多個生態系統中傳播。接合質粒、轉座子、整合子等移動基因元件是mcr-1基因水平轉移的重要載體。接合質粒是mcr-1基因傳播的主要驅動力，而IncI2和IncX4的質粒是促進大腸桿菌素耐藥性傳播的兩種主要質粒類型。mcr基因的檢測有助于追蹤、減緩和應對中國畜牧業抗生素耐藥性的出現。
本文通過使用細菌全基因組測序（WGS）來解析獲取和轉移該菌株中大腸桿菌素抗性的機制。
研究目的
探究大腸桿菌獲得粘菌素耐藥性機制
研究方法
測序技術：Illumina MiSeq+PacBio（二代+三代）
實驗對象：攜帶粘菌素抗性質粒的大腸桿菌E.coli EC11
實驗設計：分離出抗粘菌素大腸桿菌樣本E. coli EC11，進行WGS分析，確定mcr-1 基因所在質粒，進行質粒轉化實驗。?
研究結果
? E.coli EC11對抗菌和共軛化合物的敏感性
根據歐式標準，大腸桿菌EC11對多粘菌素B和甲氧芐啶磺胺甲惡唑有耐藥性，對阿莫西林克拉維酸、氨芐西林等19種常用抗生素敏感（表1）。PCR結果顯示，大腸桿菌EC11不攜帶β-內酰胺酶基因。雙盤試驗表明，大腸桿菌EC11是一種非ESBL產生菌株。
通過篩選交配試驗，攜帶mcr-1 的質粒可以成功地從供體（EC11）轉移到受體（大腸桿菌C600）。而轉化結合的EC11-T對粘菌素的最低抑制濃度值為8μg/ml，與受體大腸桿菌C600（1μg/ml）相比增加了8倍。同時，EC11-T對納利地西酸、甲氧芐啶、磺胺甲惡唑和多粘菌素B也有耐藥性。
? mcr-1陽性大腸桿菌分離株的多樣性
在文獻綜述的基礎上，共鑒定出616株大腸桿菌中245株STs，表明該菌株具有高度的基因型多樣性。Eburst分析將245個STs分解為10個克隆復合物（CC10、CC206、CC46、CCL114、CC648、CC101、CC642、CC6866、CC55和CC23）。CC10仍然是最多的克隆復合物，ST10被定義為CC10的祖先型（圖1）。MLST分析表明，大腸桿菌EC11屬于ST278家族。
這些類型分布在六大洲35多個城市，其中ST10分布在五大洲，中國是發現mcr-1 陽性大腸桿菌菌株最多的國家，共發現162個不同的STs。圖2中的245株不同ST型mcr 陽性大腸桿菌分離株中7個看家基因片段的串聯序列樹，揭示了含有mcr 基因的大腸桿菌分離株分布在不同的譜系中，而分離的EC11位于單個分支上，不屬于ST10分支之一。
? 含有mcr-1 的大腸桿菌EC11的基因組特征
全基因測序表明，大腸桿菌EC11菌株的血清型為H7。大腸桿菌EC11由一條染色體和四個質粒（pEC11a、pEC11b、pEC11c和pEC11d）組成（表2）。染色體基因組大小為4,933,784 bp，G+C含量為47.6%。EC11除發現mcr-1基因外，沒有發現其他抗性基因。
WGS結果顯示，mcr-1基因與大腸桿菌SHP45參考質粒pHNSHP45的mcr-1基因的相似度達到了100%。mcr-1基因僅位于質粒pEC11b上，長度為31,229 bp，平均G+C含量為41.40%，編碼38個ORF（圖3）。通過PlasmidFinder，質粒pEC11b具有典型的LncX4質粒的編碼復制、接合裝置和穩定性功能，這可能與質粒在不同細菌宿主之間的移動有關。同時，在大腸桿菌EC11的染色體上發現了gad（谷氨酸脫羧酶編碼）、lpfa（長極性菌毛）和iss（血清存活鐵蛋白增多）等假定的毒力基因。
? 攜帶mcr-1基因的質粒基因組特征
BLASTn分析表明，pEC11b質粒與已知的攜帶mcr-1基因的LncX4質粒非常相似，如E. coli pICBEC72H質粒、Klebsiella、pneumoniae pMCR1-IncX4質粒和Salmonella pNG14043質粒（圖4），這些攜帶mcr-1基因的IncX4 質粒表現出非常高的結構保守性。
上述質粒pEC11b、PICBEC72H,pMCR1-IncX4和PNG14043中鑒定出約2.6kb長度的mcr-1-pap2元素。另外，在pEC11b中識別出IS6元素，在PICBEC72H和PNG14043中識別出IS26，在pMCR1-IncX4中識別出tnpA（圖4）。
總 結
通過對分離的攜帶mcr-1基因的大腸桿菌EC11測序，在菌株的質粒pEC11b中鑒定出了攜帶mcr-1的lnx4型質粒，而在不同物種中攜帶mcr-1的lncx4質粒相似，這些物種來自不同的地理位置，屬于不同的STs。表明mcr-1基因的大腸桿菌菌株可以通過水平轉移傳遞抗性。因此，有必要監測和調查大腸桿菌素和其他類型抗生素的使用情況，以便采取積極的策略，保持抗生素的療效。
本研究的測序和部分數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
文章索引
Bai F, Li X, Niu B, Zhang Z, Malakar PK, Liu H, Pan Y and Zhao Y (2018) A mcr-1-Carrying Conjugative IncX4 Plasmid in Colistin-Resistant Escherichia coli ST278 Strain Isolated From Dairy Cow Feces in Shanghai, China. Front.Microbiol. 9:2833.doi: 10.3389/fmicb.2018.02833.
