2019-01-18
正文
近期，派森諾生物與東南大學合作，在《Chemosphere》（影響因子4.427）發表研究論文。本文通過垂直流人工濕地（VFCW）的營養物和銀濃度的測定，結合微生物群落的高通量測序，探究了Ag NPs對VFCW系統性能和微生物群落的影響。
研究背景
銀納米顆粒（Ag NPs）有著卓越的抗菌性能，并在多種產品中投入使用，如高性能服裝、食品包裝、醫療器械等。但隨著其使用量的增加，最終進入環境中的Ag NPs比率也在增長。目前污水處理廠是控制Ag NPs向環境釋放的重要屏障，了解Ag NPs在不同生物系統中的影響有助于改進對污水處理系統Ag NPs濃度的風險評估。
人工濕地（CWs）是去除污染物、保護水環境的重要污水生態處理系統。鑒于Ag NPs對細菌的毒性作用，Ag NPs對生物廢水處理工藝的影響越來越收到重視。到目前為止，很多工作研究了Ag NPs對序批式反應器（SBR）、膜生物反應器（MBR）等廢水系統的影響，然而Ag NPs對人工濕地的影響仍未受到足夠的重視。
在活性污泥處理中，Ag NPs可以轉化成沉淀，主要以硫化物（Ag2S）和Ag -巰基絡合物的形式吸附于廢水生物固體中。在垂直流人工濕地中，廢水可以從上至下流動。由于沉淀物的快速形成和低流動性，在垂直流人工濕地中，不同基質層在連續施加Ag NPs后可能積累不同的Ag濃度，由此對COD（化學需氧量）、氮、磷的去除以及微生物的活性和群落結構可能會產生不同的影響，但對其中的機理少有認知。
研究目的
1. 研究Ag NPs對垂直流人工濕地不同基質層COD、氮、磷去除的長期影響；
2. 闡明人工濕地不同土層微生物群落結構的變化；
3. 評價連續輸入Ag NPs后Ag NPs的分布及去除效率。
研究方法
測序技術：Illumina MiSeq高通量測序平臺
測序模式：微生物組細菌16S rRNA基因V4區測序
實驗對象：垂直流人工濕地
實驗設計：建立兩個垂直人工流濕地（wetland A和wetland B），分別包含四層：0.15 m厚的粗沸石底層（粒徑30-50 mm）、0.15 m厚的礫石中間層（粒徑20-30 mm）、0.15 m厚的小礫石上層（粒徑10-20 mm）、0.20 m厚的土壤表層。系統表層種植黃色鳶尾，密度20-25/m2。系統廢水由蔗糖、(NH4)2SO4、CO(NH2)2、KH2PO4和微量元素合成。濕地建成和植物6個月后開展正式研究。運行1個月后，系統趨于穩定。然后在合成廢水中加入Ag NPs，濃度為100 μg/L，94 d連續泵入濕地系統中，通過1. 測定土壤層、礫石層和濕地系統三個采樣點出水流中的COD、TN、NH4+-N、 TP濃度；2. 測定采樣點出水流的銀濃度以及濕地土壤和植物中的銀含量；3. 高通量測序揭示銀處理94 d后濕地系統上層和下層土壤的微生物結構變化這些方法來綜合評估Ag NPs對垂直流人工濕地系統性能和微生物群落結構的影響。
研究結果
1. Ag NPs對VFCWs系統養分去除率的影響
1） VFCWs系統COD的去除情況
如圖1a所示，wetland A不同取樣點（土壤層出水流、礫石層出水流、系統出水流）的COD濃度隨著實驗周期的變化并沒有顯著變化，土壤層出水流的COD濃度顯著高于其余兩個取樣點，而COD濃度在礫石層和系統出水流之間并沒有顯著差異。COD的去除效率為94.73%，整個周期的平均去除效率為91.59 ± 1.92%。Ag NPs對VFCW系統的影響如圖1b所示。在添加Ag NPs之前，wetland B所有取樣點出水流的COD濃度均逐漸下降，COD的去除效率升至89.97%，表明VFCW系統的不同層均可以去除有機物，其中土壤層能去除進水流大約85.47%的COD。在第26 d時wetland B開始加入100 μg/L 的Ag NPs，COD的去除效率并沒有發生顯著變化，礫石層和系統出水流的COD濃度也一直處于穩定水平。
圖1 系統120 d運行過程中COD在不同層的進水和出水流中的濃度變化和去除效率
（a）Wetland A（無Ag NPs）；（b）Wetland B（加入100μg/L Ag NPs）
2） VFCWs系統TN的去除情況
如圖2a所示，wetland A不同取樣點出水流的TN在整個實驗周期中都較為穩定，TN的最終去除效率在52.54± 3.05%。而從圖2b中可以發現加入100μg/L Ag NPs之后，不同采樣點出水流的TN濃度與未添加Ag NPs相比均有顯著上升，其TN去除效率也發生了顯著變化。
圖2 系統120 d運行過程中TN在不同層的進水和出水流中的濃度變化和去除效率
3） VFCWs系統NH4+-N的去除情況
系統NH4+-N的去除情況如圖3所示。圖3a結果顯示wetland A中的NH4+-N的去除效果在120 d實驗周期中保持在較為穩定的水平，并且系統的土壤層起著去除NH4+-N的關鍵作用。圖3b結果顯示wetland B在添加Ag NPs后NH4+-N的出水流濃度和去除效率有著較大的變化，表明Ag NPs對NH4+-N的去除有抑制作用，并且在不同層（土壤層、礫石層等）有著不同程度的毒性影響。
圖3 系統120 d運行過程中NH4+-N在不同層的進水和出水流中的濃度變化和去除效率
4） VFCWs系統TP的去除情況
系統TP的去除情況如圖3所示。圖4a結果顯示wetland A中進水流的TP平均濃度為2.69 mg/L，TP平均去除效率為72.88 ± 3.24%，出水流TP濃度在不同的取樣點有著顯著差別。圖4b結果顯示，在添加Ag NPs前，wetland B出水流的TP濃度都較為穩定，而在添加Ag NPs后，系統的出水流TP顯著增加，并且隨著處理時間的增加，其濃度也增加。該結果表明100 μg/L Ag NPs的長期處理會顯著影響濕地系統的TP去除能力，尤其對土壤層的影響最大。
圖4 系統120 d運行過程中TP在不同層的進水和出水流中的濃度變化和去除效率
2. Ag NPs在VFCWs系統的變化
在添加Ag NPs之前，wetland A和wetland B中的土壤干重銀濃度為0.29 μg/g（表1）。100 μg/L的Ag NPs連續處理94 d后，土壤銀濃度與對照相比有顯著變化，土壤干重濃度在下層土壤（0-10 cm）和上層土壤（10-20 cm）中分別上升至0.98和4.32 μg/g。如表1所示，處理94 d后，上層土壤的銀濃度顯著高于下層土壤，這表明表層土壤會積累更多的銀。
CW系統的Ag NPs去除效率如表1所示。當進水流Ag NPs濃度為100μg/L時，系統在整個實驗周期的Ag NPs平均去除效率為95.72%。土壤表層出水流銀濃度約為13.45 μg/L，并且系統土壤層去除了約為86.55%的Ag NPs。該結果表明，土壤層是CW系統去除Ag NPs的重要部分。
表1 土壤層的銀濃度和CW系統的Ag NPs去除效率
3. Ag NPs對VFCW系統中細菌群落結構的影響
在Ag NPs處理94 d后通過高通量測序測定了上層和下層土壤細菌群落結構的變化。表2為VFCW系統中不同土層微生物群落的豐富度和多樣性指數。本研究為不同土壤層的細菌群落建立了4個16S rRNA基因文庫，分別包含46937、46865（wetland B）和43908.67、40648.3（wetland A）條有效序列，并以3%的序列差異性劃分OTU，分別獲得3882（lower soil-0）、4306（lower soil-100）、4419（upper soil-0）和4439（upper soil-100）個OTU。不同土壤層的Good’s coverage值均大于0.950，表明獲得的序列文庫可以反映細菌的群落結構。如表2所示，長期施加Ag NPs使得不同土壤層的微生物豐富度和多樣性發生了改變。
共有和特有OTU韋恩圖反映了VFCW系統不同土壤層微生物群落的不同和相似之處。如圖5所示，4個群落的OTU總數為5301，其中49.76%的OTU（2638個）為它們所共有，表明多數微生物總是存在于系統的土壤層中。在這些共有的OTU中，門水平的主要分類為Proteobacteria（33.66%）、Acidobacteria（16.11%）、Bacteroidetes（8.61%）、Verrucomicrobia（6.77%）、Gemmatimonadetes（5.99%）、Spirochaetes（4.4%）、Firmicutes（3.7%）、Planctomycetes（3.76%）和Nitrospirae（2.25%）。在不同土壤層的特有OTU分別為60（lower soil-0）、106（lower soil-100）、78（upper soil-0）和73（upper soil-100），這部分OTU的總占比為5.98%。該韋恩圖表明CW系統不同土壤層的微生物群落結構差異不受特有OTU的支配。
表2 VFCW系統不同土層微生物群落的豐富度和多樣性指數
圖5 兩個土壤層施加/不施加Ag NPs下細菌群落結構的韋恩圖；門水平共有OTUs的物種分析
為了進一步鑒定不同土壤層在Ag NPs處理下的細菌群落系統發育多樣性，將有效序列歸類至已知的門、綱、目和科水平。如圖6a所示，濕地系統的細菌群落有12個主要的門，分別為Proteobacteria、Acidobacteria、Bacteroidetes、Verrucomicrobia、Gemmatimonadetes、OD1、Firmicutes、Actinobacteria、Nitrospirae、Spirochaetes、Planctomycetes和Chloroflexi，其中Proteobacteria是最為優勢的門。與對照組wetland A相比，100 μg/L的Ag NPs連續處理94 d后，Acidobacteria和Verrucomicrobia的相對豐度在下層土壤（10-20cm）中分別從14.21%和5.15%上升至23.56%和6.60%，在上層土壤（0-10cm）中分別從11.41%和6.62%上升至15.31%和8.69%；Proteobacteria、Actinobacteria、Chloroflexi、Gemmatimonadetes、Nitrospirae和Planctomycetes的相對豐度在下層土壤中上升，在上層土壤中下降；Bacteroidetes、 Firmicutes和OD1在下層土壤和上層土壤均呈下降趨勢；而Spirochaetes的相對豐度在下層土壤中下降了91.94%，在上層土壤從6.62%上升至8.69%。
如圖6b所示，這4個樣本最主要的綱分別為α-、β-、δ-和γ-Proteobacteria、Holophagae、Bacteroidia、Gemmatimonadetes、Pedosphaerae、Chloracidobacteria、Saprospirae、Opitutae、Spartobacteria、Nitrospira、Phycisphaerae、Planctomycetia和Acidobacteria-6。與對照組wetland A相比，100μg/L的Ag NPs連續處理94 d后，Holophagae、Gemmatimonadetes、Planctomycetia、Opitutae和Pedosphaerae的相對豐度在下層土壤和上層土壤均上升；而α-和β-Proteobacteria、Chloracidobacteria、Thermoleophilia、Saprospirae、Phycisphaerae、Acidobacteria-6和Spartobacteria的相對豐度在下層土壤中上升，在上層土壤中下降；δ-和γ-Proteobacteria、3Clostridia、Erysipelotrichi和Spirochaetes在下層和上層土壤中均下降。
在目水平的分析表明這些有效序列主要分為13個目，分別為Holophagales、RB41、Bacteroidales、Nitrospirales、Burkholderiales、Rhodocyclales、Desulfobacterales、Desulfuromonadales、Myxococcales、Xanthomonadales、Pedosphaerales和 Chthoniobacterales（圖6c）。與不添加Ag NPs相比，添加Ag NPs后，下層土壤中的Bacteroidales、Desulfobacterales、Desulfuromonadales和Rhodocyclales的相對豐度降低，其他目水平的物種相對豐度上升；而在上層土壤中，Holophagales、Bacteroidales、Gemmatimonadales、Desulfuromonadales、Myxococcales和Pedosphaerales的相對豐度上升，其他變現為下降趨勢。
科水平的物種組成分析為Ag NPs處理后不同土壤層的物種變化提供了更為詳細的信息。如圖6d所示，Holophagaceae、Comamonadaceae、Rhodocyclaceae、Desulfobacteraceae、Geobacteraceae、Spirochaetaceae和Chthoniobacteraceae為樣本中的優勢物種。Ag NPs處理后， Holophagaceae （Acidobacteria）的相對豐度在下層土壤中由3.23%上升至7.85%，在上層土壤中由2.82%上升至9.05%；而Desulfobacteraceae（δ-Proteobacteria）和Geobacteraceae（δ-Proteobacteria）在下層土壤中分別從4.72%和9.16%下降至1.04%和3.20% ，在上層土壤中保持較為穩定的水平。
圖6 不同土層16S rRNA基因雙端測序的分類學組成
（a）門水平 （b）綱水平 （c）目水平 （d）科水平
總結
本文通過測定VFCW系統添加Ag NPs后COD、TN、NH4+-N、TP、Ag的濃度變化以及運用高通量測序對微生物群落結構變化進行探索，得出以下結論：
（1） Ag NPs能夠影響VFCW系統氮和磷的去除能力；
（2） VFCW系統本身能夠有效去除廢水中的Ag NPs；
（3） Ag NPs會影響VFCW系統的微生物群落結構。
本研究的測序和部分數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
文章索引：Chong Cao et al. Shifts of system performance and microbial community structure in a constructed wetland after exposing silver nanoparticles. Chemosphere 199 (2018):661-669
原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0045653518302315
