2019-01-11
正文
最近，派森諾生物與上海東華大學再次合作，在《Waste Management》（影響因子4.723）發表論文，結合廢棄物處理與發酵技術，探索了copper (II)對發酵系統中乳酸產量的影響，并利用高通量測序技術與PICRUSt代謝功能預測，研究了copper (II)在增強乳酸產能的過程中微生物群落的變化與相關機理。
研究背景
隨著日益增加的生產速率，食物殘渣（FW）與剩余活性污泥（WAS）成為了兩種主要的城市有機廢物，急需得到妥善處理，以減輕環境負擔。厭氧發酵技術，能夠轉換有機廢料（如食物殘渣）中的碳，以生成具有高附加價值的化學制品。而WAS中也含有非常豐富的兼性微生物，可運用到發酵中。
乳酸是一種廣泛運用在食品、化工和制藥等諸多行業中的高價值化學制品，它的需求量年增長率高達15%，然而乳酸目前主要依靠接種乳酸菌，進行純化培養得到，經濟效率較低。而有機廢棄物的厭氧發酵是一種獲得目標產物的有效方法。
另外，金屬在一些生物過程中起著重要作用，比如，激活代謝過程中一些關鍵的酶，促進微生物細胞生長。Copper (II)不僅是很多銅依賴性酶的輔因子，并在厭氧發酵系統中對丁酸與氫的產生有積極作用，還能阻礙D-乳酸轉換為丙酮酸鹽，同時，銅的添加還能使Lactococcus lactis subsp.的生物量增加，可能促進發酵系統中乳酸的產生。因此，本研究以食物殘渣和廢棄活性污泥為發酵底物，并在發酵系統中添加銅離子，以研究銅的添加對發酵系統中乳酸產量和微生物群落的影響。
研究內容
①測定銅等四種金屬對乳酸產量的影響；
②研究銅的添加劑量對乳酸產生相關代謝過程的影響；
③研究銅的添加劑量對微生物群落結構與功能的影響。
研究目的
揭示Copper (II)在FW與WAS的聯合發酵系統中對乳酸產量的影響，以及銅對厭氧發酵系統的各種有利影響。
材料與方法
測序技術：Illumina MiSeq高通量測序平臺
測序模式：微生物組細菌16S rRNA基因V3-V4區測序
實驗對象：食物殘渣與廢棄活性污泥混合的發酵底物
實驗設計：①將打磨成漿的食物殘渣與沉降后的濃縮廢棄活性污泥，6:1混勻并添加自來水混和為發酵底物（表1），設立五個獨立的發酵反應器，其中四個分別添加Fe3+，Mn2+，Cu2+和Mg2+（表2），每天取一次樣，并用0.45 μm的濾膜過濾，測定L-乳酸和D-乳酸。
表1：發酵底物相關信息
②測定WAS中的初始銅離子濃度后，設立四個獨立的反應器，分別命名為Blank，Cu-15，Cu-30和Cu-70，并分別添加不同劑量的銅離子（0，15，30，70μM-Cu2+/g VSS），每日取一次樣，測定L-乳酸、D-乳酸、可溶性碳水化合物、可溶性蛋白質和NH4+-N的濃度。并通過FT-IR光譜法，在第四天測定Blank，Cu-15和Cu-70樣本中的化學基團變化，在前三天測定α-葡萄糖苷酶和蛋白酶的酶活性。Blank和Cu-15中的樣本還進行了EEM熒光光譜分析。
③當乳酸產量穩定后，從Blank，Cu-15和Cu-70中取樣，利用Illumina MiSeq高通量測序平臺，測定微生物組細菌的16S rRNA基因V3-V4區，以分析微生物群落結構與功能。
結果與討論
? 金屬離子對乳酸產量的影響
前三天里，添加了四種金屬離子的發酵系統中乳酸的濃度如表2所示，在第一天時，四種添加了金屬離子的發酵系統中，只有添加了銅離子的發酵系統，乳酸的濃度要比對照組高33%，其余金屬離子對乳酸的產生都沒有顯著的積極影響，同時，添加銅離子的發酵系統中，乳酸的消耗率（CR）（42.72%）（表2）也遠低于其它發酵系統。這表明，發酵系統中，銅離子的添加確實有利于乳酸的生產。
表2：五種發酵系統中的乳酸濃度
? 銅離子的添加劑量對乳酸產量的影響
添加不同濃度的銅離子后，各發酵罐中乳酸濃度隨時間的變化如圖1所示，銅離子的確對FW WAS聯合發酵系統中乳酸的產生有積極影響，所有添加了銅離子的發酵系統的最高乳酸濃度都高于對照組，其中，Cu-15中的最高乳酸濃度為23.21 g/L，比對照組（13.11 g/L）高77%。不過，隨著銅離子添加劑量的增加，乳酸的產量卻呈降低的趨勢，這表明，在發酵系統中添加合適劑量的銅離子，對乳酸的生產更有幫助。
同時，在整個發酵過程中，Cu-70的乳酸產生率在前兩天都較低，這可能是由于銅離子對細胞的生長具有抑制作用。圖1中，餅圖展示的是對應發酵系統中乳酸濃度最高時，L-乳酸與D-乳酸的比例，可以發現，隨著銅離子添加劑量的增加，D-乳酸的比例也呈增加的趨勢。
圖1 不同濃度銅離子的添加對FW與WAS聯合發酵系統中乳酸產量的影響（圖中餅圖展示的是對應發酵系統中乳酸濃度最高時，L-乳酸與D-乳酸的比例）
? 銅離子對乳酸發酵代謝的影響
FT-IR光譜的測定結果顯示，Cu-15和Cu-70發酵系統中固相吸收帶的波數和對照組的波數相似，這表明，銅離子的添加并沒有影響到發酵底物內部的化學鍵。四個發酵系統中，可溶性碳水化合物的最大濃度、1~3天內α-糖苷酶的酶活性和碳水化合物消耗率如圖2所示。加入了銅離子的反應器中，α-糖苷酶的酶活性均要高于對照組，Cu-15中，碳水化合物的消耗率最高，隨著銅離子添加劑量的增加，碳水化合物的消耗率降低，這表明，銅離子的添加可以通過增強糖酵解途徑來提高發酵系統中乳酸的產量。
圖2 各發酵系統中，可溶性碳水化合物的最大濃度、1-3天內α-糖苷酶的酶活性和碳水化合物消耗率
如圖3所示，Cu-15中的蛋白酶活性低于對照組，peak A（蛋白類，Ex/Em = 290/360）與peak B（氨基酸類，Ex/Em = 360/450）都高于對照組，這表明，銅的添加能抑制水解，從而使系統中的蛋白含量增加。
圖3 1~3天Cu-15與Blank中的蛋白酶活性（a）；Cu-15與Blank A峰與B峰熒光強度（b）；第三天時，Blank（c）與Cu-15（d）中發酵液的EEM光譜
發酵七天后，四個反應器中VFA（揮發性脂肪酸）的濃度與組成情況如圖4所示，隨著乳酸的消耗，Blank、Cu-15和Cu-30中的VFA都有極大程度的增長，而Cu-70中的VFA含量卻一直保持在一個很低的水平上（0.47 ± 0.23 g/L），同時，Cu-70中VFA的組成也主要是乙酸，而其它三個發酵系統則是以乙酸和丙酸為主。
圖4 發酵七天后，四個反應器中VFA的濃度（a）與VFA的組成情況（b）
? 銅離子的添加對微生物群落的影響
乳酸發酵的生物過程在很大程度上與微生物群落的結構有關。Blank、Cu-15和Cu-70中的微生物多樣性指數如表3所示。Cu-15與Cu-70中的Shannon指數均低于對照組，數據分析顯示，Blank與Cu-70只有502個共有OTU，而與Cu-15有848個共有OTU，即銅離子的添加使菌群發生了改變。
門和屬水平下的微生物群落結構如圖5所示?？梢园l現，銅離子的存在使微生物群落發生了顯著改變，這三個反應器中的細菌主要屬于Proteobacteria 和Firmicutes，這兩種類群的微生物常見于活性污泥中，同時，Blank和Cu-15中分別有高達82%和88%的Firmicutes，而Cu-70中細菌類群則主要以Proteobacteria 為主，含量高達96%。
在屬水平上，Blank中的細菌主要屬于Lactobacillus（57.6%），Streptococcus（23.9%），Pseudomonas（2.0%），Dechloromonas（1.5%）；Cu-15則主要有Lactobacillus（86.2%），Leuconostoc（2.0%），Pseudomonas（1.8%）；而Cu-70中卻以Acinetobacter（43.3%）為主。即隨著銅離子添加濃度的增加，細菌微生物群落中的Lactobacillus和Streptococcus相對豐度顯著減少，在Cu-15中豐度很高的Lactobacillus在Cu-70中只有0.05%，這表明，70 μM-Cu2+/g VSS超過了Lactobacillus的耐受性。
表3：Blank、Cu-15和Cu-70這三個發酵反應器中的多樣性指數與OTU數統計
圖5 門和屬（相對豐度>0.1%）水平下Blank，Cu-15，Cu-70的細菌群落組成
? 微生物群落功能基因分析
PICRUSt功能預測分析的部分結果如圖6所示。Cu-15中膜轉運和碳水化合物代謝的相關基因豐度較高。同時，Cu-15中與遺傳信息處理相關的基因豐度也較其它兩個系統更高，這些基因與細胞生成和增殖密切相關，這可能也是Cu-15中乳酸產量最高的原因。圖6b中是與復制和修復相關基因的豐度，可以明顯看出，Cu-15中，與RNA聚合酶、翻譯因子、DNA復制、DNA復制蛋白和蛋白折疊相關的基因豐度都高于其它系統。這表明，Cu-15中的自體調節系統活力較高。如圖6c所示，Cu-70中，離子與電子傳遞載體相關的基因豐度非常高，這可能是因為銅會通過Cu2+與Cu1+之間的轉換參與生物氧化還原反應。
圖6 Picrust預測的部分KEGG第二等級分布圖（a），復制與修復分類下的部分代謝通路相關基因分布（b），細胞過程與信號的部分代謝通路相關基因豐度分布（c）
總 結
本文結合廢棄物處理與發酵技術，探索了copper(II)對發酵系統中乳酸產量的影響，并利用高通量測序技術與PICRUSt代謝功能預測，研究了copper(II)在增強乳酸產能的過程中微生物群落的變化與相關機理，得到以下結論：
①銅離子的確能增強發酵系統中的乳酸生產能力，當添加量為15 μM-Cu2+/g VSS時，發酵系統能比對照組高出77%以上的乳酸產量；
②銅離子的添加，能夠增強α-糖苷酶與糖酵解酶類的活性，為后續的酸化過程增加了底物；
③當銅離子的添加量達到70 μM-Cu2+/g VSS以上后，會抑制乳酸轉換為VFA，使乳酸濃度趨于穩定；
④少量的銅離子（15 μM-Cu2+/g VSS）會使產乳酸的Lactobacillus 增殖率達到82.6%；
⑤當銅離子的濃度相對較低時，微生物的自體調節系統是有活性的，同時，膜轉運功能與碳水化合物代謝能力也很強。
本研究的測序和部分數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
文章索引
Ye T, Li X, Zhang T, et al. Copper (II) addition to accelerate lactic acid production from co-fermentation of food waste and waste activated sludge: Understanding of the corresponding metabolisms, microbial community and predictive functional profiling[J]. Waste Management, 2018: S0956053X18301703.
原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0956053X18301703
