2018-01-09
溫熱的南方，偶爾可見到一種“發型”很酷的卷羽雞，羽毛蓬松翻卷，特性獨立，在觀賞雞育種中頗受青睞；卷曲的羽毛還能促進家雞散熱，從而“淡定”應對高溫，這對改善熱帶高溫地區家雞的生產性能也有重要的經濟價值。
上海交通大學孟和教授課題組和廣東海洋大學杜炳旺教授研究團隊開展合作，采用群體基因組學策略，探究中國麒麟雞卷羽特征的遺傳機制。
材 料
（1）GWAS研究材料：選取麒麟雞（卷羽）和懷鄉雞（正常）正反交構建F1、F2家系。選取F1代（18）、F2代（57）
（2）RNA-seq研究材料：3只麒麟雞（KRC）、3只懷鄉雞（HX）的卵泡組織（發育13天的胚胎）
方 法
(1) 參考基因組：Gallus gallus (galGal5)
(2) 研究策略(ddGBS)：測序平臺(Illumina HiSeq 2000)；平均測序深度：3 ×；
簡化測序酶切組合：Pst I 和 Msp I。
(3) 軟件：基因分型(BWA，GATK)；全基因組關聯分析(PLINK)； RNA-seq分析(TopHat 2； DESeq R package)。
KRC（麒麟雞）與HX（懷鄉雞）雜交種群的鑒定
KRC與HX的正反交實驗表明，KRC的卷羽特征（圖1）是由常染色體基因控制的不完全顯性遺傳，符合孟德爾遺傳定律。
圖1：卷羽與正常雞的表型比較
成年的麒麟雞（a、b）與正常的雞（c、d）相比，羽毛卷曲性狀明顯；出生1天的麒麟雞（e）就表現出卷羽特征。
全基因組關聯分析(GWAS)
通過對F1（18只）和F2（28只純合卷羽雞、29只羽毛正常雞）共75只雞進行簡化基因組測序，獲得1464 million條reads，數據過濾后，與參考基因組比對，獲得的1,948,658個SNPs，進行全基因組關聯分析，進而定位與麒麟雞卷羽性狀相關的位點。
關聯分析結果顯示：共計獲得32個與麒麟雞卷羽特征相關聯的SNPs位點(圖2)。大多數主效的SNP位點位于KRT75L4 基因第5個外顯子附近的130Kb的范圍，其他的SNP位點位于F基因（KRT75L2、KRT5、KRT7 和KRT6A）的33號染色體附近1.19-1.52Mb范圍內，位于33號染色體的候選的QTL位點與α-角蛋白基因家族重疊。
圖2：麒麟雞和懷鄉雞GWAS關聯分析曼哈頓圖
圖a曼哈頓圖顯示所有SNP與卷曲羽毛表型的聯系。不同顏色代表不同染色體，紅色線為閾值線。圖b為33號染色體的曼哈頓圖。
麒麟雞變異基因KRT75L4 的鑒定
前人報道的控制卷羽矮雞的KRT75、KRT6A 基因并不是控制麒麟雞卷羽的基因，通過對候選基因（KRT5、KRT6A、KRT75、KRT75L2 和KRT75L4）進行PCR擴增，結合sanger測序，發現KRT75L4 基因有15bp的缺失（圖3），改變了編碼蛋白的序列，造成麒麟雞卷羽的特征。
圖3：KRT75L4基因的15 bp缺失及其側翼序列的熒光信號峰。
1,294,968的序列是參考基因組（Gallus_gallus-5.0）的33號染色體起始位點；參考基因組上、下序列分別來自HX和KRC個體，KRC缺失15bp；藍色、紅色背景分別為缺失的上下游序列。
RNA-seq分析麒麟雞卷羽和正常懷鄉雞的基因差異性表達
對3只麒麟雞（KRC）和3只懷鄉雞（HX）的卵泡組織進行RNA-seq，每個樣品獲得>37.4 million 的reads，分析結果顯示，KRC和HX比較，共計有94個差異表達的基因(DEGs) ( |log2(K/H)| > 1; adjusted P-value < 0.05)。KRC與HX相比，50個基因上調，44個基因下調，進一步對差異表達基因進行功能分析，差異表達基因不在GWAS定位的33號染色體目標區段上，也不屬于α-keratin基因家族。
麒麟雞的KRT75L4 基因的表達水平與懷鄉雞一致，由于F型缺失，其轉錄產物較懷鄉雞短（圖4），導致了Val-Leu-Pro-Ala-Ser轉錄產物的缺失，影響了編碼蛋白的表達。33號染色體的其他α-角蛋白家族的基因的轉錄本在KRC和HX中是一致的，因此KRT75L4 基因可能是控制家雞卷羽性狀的F基因。
圖4：KRC和HXC品種的KRT75L4 轉錄本可視化
HX group和KRC group的覆蓋區域分別為橙色和綠色，在KRC group的三個樣本中觀察到中前區域的缺失的覆蓋度，這是由于F型缺失導致的。
小 結
研究人員采用群體基因組學策略對麒麟雞群體中受到選擇作用的基因進行檢測，并在其他家雞群體中進行了驗證，最終將候選基因鎖定在第33號染色體的KRT75L4 基因。該基因和之前報道的KRT6A 基因同屬α-角蛋白（α-keratin）基因家族，該基因家族在毛發生長中發揮著重要的作用。
此外，該工作表明群體基因組學分析可以應用于孟德爾性狀（Mendelian trait）定位研究，相比于基于構建雜交譜系進行連鎖分析的傳統策略，群體基因組學分析顯得更加簡便易行。
參考文獻
Dong J, He C, Wang Z, et al., A novel deletion in KRT75L4 mediates the frizzle trait in a Chinese indigenous chicken. Genet Sel Evol. 2018, 50(1):68. (doi: 10.1186/s12711-018-0441-7)
