2018-12-20
文案 | 微生物組事業部
派森諾生物與廣東省微生物研究所合作，在《Frontiers in Immunology》（影響因子5.511）上發表文章，研究靈芝破壁孢子提取物的抗腫瘤活性，發現可以通過重塑腸道菌群修復消耗殆盡的細胞毒性T細胞。
研究背景
乳腺癌是常見的癌癥之一，也是全球女性癌癥相關死亡的主要原因，人們一直在努力尋找療效更好但副作用更少的替代方案。目前，手術切除、輔助化療、放療和激素治療是早期乳腺癌的主要治療選擇，但由于出現耐藥性和毒副作用，仍不能令人滿意。更令人不安的是，三陰性乳腺癌對激素療法沒有反應。最近利用免疫檢查點阻斷的癌癥免疫治療的成功，已經改革了各種侵襲性腫瘤疾病的治療。
靈芝是一種藥用真菌，幾千年來一直被用于傳統中藥，可以用于治療過敏，心血管疾病，糖尿病，等。越來越多的研究結果表明靈芝孢子（SG）可能是一種可用于癌癥治療的抗癌藥物。近年來，基于孢子破壁技術，從靈芝孢子中分離出來的活性成分，因其多種多樣的生物活性，引起了人們的廣泛關注。
本研究在乳腺癌異種移植小鼠模型中探索靈芝破壁孢子提取物（ESG）的抗癌潛能，主要關注T細胞修復與腸道微生物群的相互作用，了解破壁孢子的抗癌活性。
研究方法
測序技術：Illumina MiSeq平臺
測序模式：16S rRNA基因V3-V4區?
實驗設計
研究結果
1
ESG抑制腫瘤生長
從圖1A可以看出，不管ESG處理24h還是48h，4T1細胞的體外存活率均不受影響，提示ESG的抗腫瘤活性不是由細胞毒性直接介導的。在21天的實驗期間，Model組的腫瘤體積持續增加（圖1B和C）。相比較之下，PTX和ESG組中腫瘤體積在15天后顯著減少。HE染色組織學分析顯示，Model組腫瘤細胞分布均勻，而PTX組和ESG組表現出明顯的壞死癥狀。
圖1：ESG對4T1異種移植模型小鼠的影響
2
ESG恢復外周血和腫瘤微環境中的Tc細胞
流式細胞儀(FCM)分析結果表明在外周血中（圖2），Model組中T細胞（CD3+）百分比明顯低于Normal組，輔助T細胞（Th）和細胞毒性T細胞（Tc）比例也明顯下降。相對于Model組，PTX導致Th和Tc嚴重損失。另外ESG顯著提高了循環系統中Tc細胞的百分比，也明顯提高了Tc/Th的比值。
為更詳細地觀察TME免疫監測系統，采用流式細胞儀（FCM）測定TIL。結果表明，雖然T細胞的比例有所下降，但仍有一定的抑制作用。ESG組TME中Tc細胞比例明顯升高（p < 0.05），ME中Tc細胞比例升高Tc/T比值（p < 0.01），這和外周血的結果一致（圖3）。然而，ESG在體外直接作用于脾細胞時，對Tc細胞的這種促進作用并不存在。
圖2：ESG對外周血T細胞的影響
圖3：ESG對腫瘤浸潤性淋巴細胞的影響
3
ESG抑制免疫檢查點
為進一步評價ESG對T細胞狀態的增強作用，研究了兩種免疫檢查點的表達情況，PD-1和CTLA-4。圖4顯示在脾臟中，4T1-細胞異種移植顯著上調了pd1基因的表達，同時降低了PD-1蛋白含量。相比較之下，PTX和ESG明顯下調了pd1基因的表達，但是對PD-1蛋白沒有影響。在腫瘤組織中，PTX顯著增加了PD-1蛋白的表達，同時mRNA水平幾乎和Model組一致。ESG對PD-1表現出明顯的抑制作用，特別是ESGH組對mRNA和蛋白質有著強烈的抑制作用。
對CTLA-4分析（圖5）發現，腫瘤異種移植明顯上調了脾臟中mRNA和蛋白質的表達，同時PTX和ESG顯著減少了他們的表達。在腫瘤（圖6）中，PTX減少了mRNA水平的含量，但是增加了蛋白質的表達。比較發現，不同劑量的ESG都顯著下調了ctla4，但是對CTLA-4沒有明顯的影響。
圖4：ESG對脾臟和腫瘤中PD-1的影響
圖5：ESG對脾臟中CTLA-4的影響
圖6：G對脾臟中CTLA-4的影響
4
ESG調控腸道菌群
ESG治療后腸道菌群的整體結構調整
挑選Normal組，Model組和ESGH組進行高通量測序，發現共有OTU 1,480個，分別特有889個，723個和541個OTU（圖7A）。Alpha多樣性分析結果表明，相對于Normal組，ESGH組中隨著Chao1和ACE指數的降低，豐富度明顯減少（圖7B）。稀疏曲線結果（圖7C-D）中的豐富度（Chao1）表現出了顯著差異，但是多樣性（Shannon）并沒有在三組間發現差異。
PCA和NMDS（圖8A和B）結果說明Model組和Normal組樣本有顯著的構成變化，3周的治療之后，ESGH組的構成和Normal組相似，說明ESGH組有修復菌群的效果。Unifrac距離分析（圖8C）證明ESG可以重塑菌群結構。
圖7：糞便菌群Alpha多樣性分析
圖8：糞便菌群Beta多樣性分析
ESG治療后腸道菌群的物種變化
物種組成分析結果顯示Normal，Model和ESGH組樣本中，門和屬水平上物種有顯著差異。
所有組共有9個門（圖9A），其中Firmicutes 和Bacteroidetes 占比超過了90%，Actinobacteria，Bacteroidetes，Cyanobacteria，Firmicutes 和Proteobacteria 在三組樣本間有顯著差異。特別是ESGH治療后顯著提高了Firmicutes 和Proteobacteria 的相對豐度，但是降低了Actinobacteria，Bacteroidetes 和Cyanobacteria的相對豐度，說明腫瘤異種移植明顯逆轉了的菌群的變化（圖9B）。
在屬水平，共鑒定到61個物種，從熱圖的聚類分析結果中可以看到Model組表現出明顯的菌群變化（圖10A）。在Normal組和ESGH組中發現Helicobacter，Rikenella 和Turicibacter 的相對豐度要明顯高于Model組，據報道這三個屬與增強免疫反應呈正相關；還有其他15個屬在Model組中的相對豐度要高于Normal組和ESGH組（圖10B）。
圖9：門水平物種組成分析
圖10：屬水平物種組成分析
ESG治療調控腸道菌群功能
PICRUSt菌群代謝功能預測分析結果（圖11）發現腫瘤異種移植顯著上調了一些基因的豐度，這些基因調控5個代謝通路，包括其他次生代謝產物的生物合成，能量代謝，酶家族基因，多糖生物合成和代謝，輔助因子和維生素的代謝，運輸和分解代謝，但是下調基因涉及細胞運動性和信號傳導通路。
ESGH治療后，這些基因的變化卻明顯是相反的，例如運輸和分解代謝，酶家族基因，多糖生物合成和代謝，其他次生代謝產物的生物合成。說明結合結構調控，ESG可調節腸道菌群的代謝活動，促進對腫瘤免疫的監測作用。
圖11：KEGG數據庫菌群功能預測
總 結
研究結果表明ESG能夠在體內而非體外抑制4T1腫瘤生長，且ESG能顯著增加荷瘤小鼠外周血中Tc的數量和Tc與Th的比例，可以通過抑制共抑制檢查點有效修復T細胞。
16S rRNA基因測序結果說明ESG可以將荷瘤小鼠的整體結構按照正常小鼠進行重塑，證明ESG可以作為一種天然的抗癌佐藥，這對乳腺癌治療有重要的臨床意義。
本研究的測序和數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
參考文獻
Jiyan S , Lu S , Dan L , et al. Antitumor Activity of Extract From the Sporoderm-Breaking Spore of Ganoderma lucidum: Restoration on Exhausted Cytotoxic T Cell With Gut Microbiota Remodeling[J]. Frontiers in Immunology, 2018, 9:1765-.
原文鏈接：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2018.01765/full
