2018-11-14
文案 | 轉錄調控事業部
研究簡介
假單胞菌屬是一種具有復雜基因組結構的，廣泛分布且具有生態重要性的海洋譜系菌。通過研究來自北冰洋的冷適應型假單胞菌BSW20308的基因組到其對溫度變化的轉錄組學反應，發現了該菌兩條染色體的進化及其在適應溫度變化反應中的不同作用。sRNome (the complete set of small RNAs in the organism)的廣泛參與，特別是新型sRNA與tmRNA和6S RNA的共同作用，也被預測在熱應激下發揮重要作用。
這項工作證明了多分體基因組的進化以及sRNome在該海洋屬的環境適應中的重要性。它更新了人們之前對假單胞菌的理解，并在轉錄組水平，揭示了環境對海洋微生物的影響。
研究方法
基因組：測序平臺PacBio RS II
轉錄組：將P. fuliginea BSW20308在4°C、15°C和32°C，三個溫度下一式三份， 9個樣本，培養至早期穩定期，提取RNA，Illumina NextSeq 500測序?
研究結果
? P. fuliginea BSW20308基因組的一般特征
研究結果顯示P.fuliginea BSW20308基因組包括大染色體（chr1,3,924,123bp,GC含量為39.1％）和小染色體（chr2,906,103bp，GC含量為38.7％）。在7個rRNA操縱子中組織了總共23個rRNA基因，其中6個在chr1上，1個在chr2上。 oriC區域（oriC1和oriC2）在序列上顯著不同。 在chr1和chr2上分別檢測到總共12個和2個基因組島（GIs）。分別在chr1和chr2上預測了5個和2個推定的次級代謝物生物合成基因簇（SMGCs）。 SMGC可能產生細菌素，芳基多烯，非核糖體肽和其他類型的天然產品。 在chr1上檢測到41.1kb的完整原噬菌體和8.1kb的不完整原噬菌體。在chr2上預測了6.5kb的不完整原噬菌體。在chr1和chr2上分別鑒定出四個和一個有規律的間隔短回文重復序列（CRISPR）。
? 兩條染色體的注釋和比較
根據RBH分析，兩條染色體共有212個直系同源物，分別占chr1和chr2基因的6％和26％（圖A）。直系同源物中最豐富的直系同源簇（COG）是K類（轉錄），其比例高于染色體特異性基因（圖B）。chr1和chr2特異性基因的最豐富的COG類別分別是功能組T（信號轉導機制）和R（僅一般功能預測）（圖1B）。與chr1相比，chr2特異性基因和直向同源物：R（僅一般功能預測），S（功能未知），Q（次級代謝產物生物合成，轉運和分解代謝），U（細胞內運輸，分泌和囊泡運輸），I（脂質轉運和新陳代謝）和F（核苷酸轉運和代謝）（圖B）。與chr2相比，更高比例的chr1特異性基因屬于COG類別M（細胞壁/膜/包膜生物發生），J（翻譯，核糖體結構和生物發生）和H（輔酶轉運和代謝）（圖B）。
KEGG途徑分配顯示chr1，chr2特異性基因和直系同源物之間存在一些差異。 例如，chr1特異性基因在能量代謝和翻譯，以及折疊，分選和降解通路中占最高百分比（圖C）。在異生素生物降解和代謝，萜類化合物和聚酮化合物的代謝以及核苷酸代謝的途徑中，chr2特異性基因的比例高于chr1（圖C）。 chr2特異性基因中不存在一些代謝途徑，包括聚糖生物合成和代謝，轉錄，折疊，分選和降解等（圖C）。
? 第二條染色體的必要性
P. fuliginea BSW20308的第二條染色體除了rRNA基因外還具有必需基因。 例如，參與細胞分裂的minCDE，編碼組氨酰-tRNA合成酶的hisS，類異戊二烯生物合成的脫氧木酮糖途徑中的gcpE，以及編碼DNA復制末端位點結合蛋白的tus，對于正常生長和存活是必需的，并且僅在chr2上檢測到。組氨酸生物合成基因簇含有8個緊密連鎖的基因hisIFAHBCDG，僅存在于chr2上。
? 系統發育和時間尺度分析
本文選擇了9個代表性的具有兩條染色體的假單胞菌屬完整基因組來構建具有P. fuliginea BSW20308的系統發育樹。兩條染色體樹在9個物種中顯示出相同的系統發育關系，分枝長度略有不同（圖A和B）。基于全基因組的系統發育樹也支持這些物種的相同系統發育關系（圖C）。它清楚地顯示了第一和第二染色體的單獨聚類（圖C）。根據時間估計（圖D），P.atlantica T6c在大約8.3億年（Ma）之前首先與其他假單胞菌分開。假單胞菌屬OCN003是剩余的假單胞菌屬的第二種不同物種。
有趣的是，正如估計的那樣，北極株P. fuliginea BSW20308和南極株P. haloplanktis TAC125在大約113 Ma之前的分歧之前共享一個假定的祖先。
? RNA-seq 數據聚類
轉錄組研究了在4°C、15°C和32°C生長的P.Fuligina BSW20308，這三種溫度分別代表顯示顯著增長的最低（LT），最佳（OT）和最大溫度（HT）。測序結果每個樣本產生超過4G的數據量。此外PCA分析和Pearson相關分析一起表明，相同溫度處理中的生物學重復相似性很高，可以組合以代表在相同條件下的總體基因表達。
? 將RNA-seq數據比對到基因組
超過97％的clean reads被比對到基因組，映射到chr1上CDS的reads的平均百分比隨著溫度升高而降低，從LT的平均60.32％到HT的22.39％（表1）。除了CDS之外，非編碼RNA基因和未知的基因間區域（IGR）在chr1上以不同程度轉錄（表1）。在HT處檢測到高百分比的tmRNA（38.01％）和未知的IGR（25.85％），甚至高于在該條件下轉錄的CDS（22.39％）（表1）。 RNase P RNA在OT時具有最高的平均百分比，在HT時具有最低的平均百分比。在三種溫度處理下檢測到相似水平的tRNA基因轉錄（約0.6％）。相反，在9個轉錄組中僅在chr2上檢測到CDS（超過97％）和未知的IGR（約1-2％）（表1）。
? IGRs內新轉錄本的預測
在高溫處理下，未知的IGR在chr1上以相對高的水平轉錄。映射到未知IGR的最豐富reads與位于chr1上編碼GNAT家族乙酰轉移酶（D172_RS06075）和編碼假設蛋白（D172_RS06080）的基因之間的序列相同，占每個未知IGR中所有未知IGR的99％以上。預計該區域含有316nt的新型sRNA，在此命名為Pf1 sRNA，其在Rfam數據庫中沒有相似的序列。除了這種新的sRNA之外，還在未知的IGR中預測了另外25種新的轉錄本，包括另外14種新的sRNA候選物和11種非RNA編碼的新轉錄本。其中，一個新的sRNA（Pf15 sRNA）和兩個新的轉錄本（PfNT1和PfNT2）位于chr2上，而其余的預測轉錄本都位于chr1上。
由于在HT下，Pf1 sRNA是檢測到的最主要的轉錄物，因此對Pf1 sRNA和基因表達在轉錄組中的潛在相關性進行研究。使用Pearson r相關性，發現多達644個基因的轉錄與Pf1 sRNA顯著相關（P值<0.01）。其中，12個基因與Pf1 sRNA呈正相關，其余632個基因均與Pf1 sRNA呈負相關。
根據eggNOG分類，大量基因未被分配到COG功能類別中。 632個負相關基因主要分為COG類別S（功能未知），E（氨基酸轉運和代謝），C（能量產生和轉化），R（僅一般功能預測），J（翻譯，核糖體結構和生物發生），U（細胞內運輸和分泌）和H（輔酶轉運和代謝）。
? 與溫度和染色體相關的差異表達
在HT與LT，HT與OT和LT與OT的成對比較中，在基因組中檢測到總共1446,709和759個差異表達的基因（DEG）。 成對比較中DEG的火山圖顯示在圖A中。 在HT處的DEGs比在LT和OT處的表達下調得更多，并且在LT處的DEG上調比在OT時更多。構建熱圖以顯示在所有成對比較中具有log2（倍數變化）超過5的DEGs（圖B）。在熱圖中顯示的14個基因中，只有3個基因位于chr2上。在上調基因中，8個位于chr1附近并且在相同方向上定向（圖C）。
根據eggNOG，GO和KEGG分類對來自兩條染色體的DEG進行分析。 在HT與LT的比較中，大多數eggNOG類別被下調，并且在chr1上LT與OT的比較中更多類別被上調。在chr2上，大多數DEG在HT處被上調。 與eggNOG分析類似，大多數GO類別中的更多DEG在chr1處的HT處被下調，并且在chr2處被上調。 KEGG途徑表現出與GO和eggNOG分析類似的模式，然而兩種染色體都具有在不同KEGG途徑中富集的DEG。例如，大多數DEG位于chr1上的翻譯途徑和chr2上的膜轉運途徑中。
? QPCR驗證
對8個隨機選擇的基因成功進行qRT-PCR。對于三個溫度成對比較，qRT-PCR結果顯示與RNA-seq數據一致，因此來自qRT-PCR的實驗數據證實了RNA-seq的轉錄組分析數據的可靠性。
