2018-11-09
正文
最近，派森諾生物與中國農科院油料作物研究所合作，在《Food Research International》（影響因子3.520）再次發表論文，利用高通量測序技術，研究了白藜蘆醇和芥子酸對因高脂飲食而引起的腸道菌群紊亂的作用，并探究這兩種酚類物質的攝入對大鼠腸道菌群所造成的具體影響。
研究背景
高脂飲食（HFD）會引起肥胖，導致機體產生氧化應激、低度炎癥反應與腸道菌群失調的癥狀。而腸道菌群在人體的營養和健康上起著關鍵作用，它們能夠提供人體必需的營養物質、阻止病原菌的繁殖、維持粘膜免疫，并調節脂肪的儲存與代謝，但也會受到遺傳背景、免疫狀態、宿主年齡的影響，并對攝入的飲食具有強烈響應。
氧化應激能夠反應機體中活性氧簇的產生能力與活性中間體解毒能力之間的平衡關系，在人類與大鼠脂肪積累時氧化應激的增加是肥胖相關代謝綜合征的一個重要疾病機制。
白藜蘆醇與芥子酸是兩種常見多酚類化合物，其中白藜蘆醇具有抗炎抗肥胖的作用，可能可以改善血清的葡萄糖水平與胰島素抗性。近年來，芥子酸與其主要衍生物被許多研究人員認為是有效的抗氧化、抗癌、抗菌和消炎藥物。
目前，關于這些生物活性物質是否可在體外緩解氧化應激的研究還非常少，也鮮少有人研究芥子酸對腸道菌群的生物轉化。因此，本研究分析了白藜蘆醇、芥子酸，以及這兩種酚類物質的混合物對高脂飲食引起的腸道菌群紊亂的影響，為后續研究多酚類物質對由高脂飲食所引起的，與肥胖和氧化應激有關的營養基因組改變的作用提供基礎。
研究目的
1. 研究白藜蘆醇和芥子酸對因高脂飲食而引起的腸道菌群紊亂的作用；
2. 分析白藜蘆醇和芥子酸的攝入對大鼠腸道菌群所造成的具體影響。
研究方法
測序技術：Illumina MiSeq高通量測序平臺
測序模式：微生物組細菌16S rRNA基因V3-V4區測序
實驗對象：大鼠糞便
實驗設計：將30只6周齡的雄性大鼠隨機分成5組，分別以普通飲食（CT）、高脂飲食（HF）、混有白藜蘆醇的高脂飲食（HFR）、混有芥子酸的高脂飲食（HFS），以及同時混有白藜蘆醇和芥子酸的高脂飲食（HFC）喂養8周（見表1），每周記錄一次大鼠的體重，每周監測兩次進食量。最后在對大鼠實施安樂死的前兩天，進行口服葡萄糖耐量試驗（OGTT），在大鼠口服葡萄糖前后分別記錄每只大鼠的血糖濃度，并于口服葡萄糖后的30 min、60 min、90 min時記錄大鼠血糖濃度。收集大鼠糞便樣本，并在干預期結束后的清晨采集空腹一夜的大鼠血液。最后解剖大鼠，收集肝臟與結腸組織。
采集的血液樣品用于測量空腹血糖值、胰島素水平、總膽固醇（TC）、甘油三酸酯、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和非酯化脂肪酸（NEFA）濃度，以進行生物化學分析，大鼠肝臟與結腸組織則用于氧化應激檢測，糞便樣本用于通過高通量測序技術測定大鼠腸道菌群。
表1 各組大鼠的飲食策略
組名 | 飲食 | 重復數 |
CT | 普通飲食 | 5 |
HF | 高脂飲食 | 5 |
HFR | 白藜蘆醇+高脂飲食 | 5 |
HFS | 芥子酸+高脂飲食 | 5 |
HFC | 白藜蘆醇+芥子酸+高脂飲食 | 5 |
研究結果
血糖和脂質代謝平衡
實驗數據顯示（表2），各組大鼠之間的體重變化無差異，不過高脂飲食的大鼠中，喂食了白藜蘆醇的兩組大鼠，體重相對較低，而只在飲食中添加芥子酸的大鼠，體重并沒有增加或減少。同時，喂食了白藜蘆醇的大鼠血糖水平低于高脂飲食的大鼠，胰島素抵抗指數（HOMA-IR）也有降低。如圖1a所示，所有實驗組的TC與LDL-c都沒有差異，HFS組大鼠的TG和NEA水平低于HF組，HFR組的HDL-c水平高于HF組，且較高于CT組。
表2 大鼠體重指標與血漿生化指標
圖1 攝食多酚對高脂飲食大鼠血脂（a）和葡萄糖耐受性（b）的影響
2. 口服葡萄糖耐量試驗（OGTTs）
OGTTs實驗顯示，在給大鼠口服葡萄糖后的60-120 min內，相較于對照組大鼠，高脂飲食組大鼠（HFD）的血糖水平更高，這表明高脂飲食會損害葡萄糖耐受性。另外，HF組大鼠的AUC值（曲線下面積）也高于CT組大鼠，補充酚類的HFD大鼠在每個時間點的血糖水平都有所降低，芥子酸的攝入使HFD大鼠的AUC呈減少的趨勢，但攝入白藜蘆醇的兩組大鼠和HF組大鼠的AUC值沒有差異（圖1b）。
3. 多酚物質對氧化應激的緩解
八周的高脂飲食，導致了大鼠肝臟、結腸與血漿中的氧化應激。芥子酸的補充，使血漿、肝臟和結腸中的ROS（活性氧）水平分別減少了13.5%、12.6%、27%，其中，只有結腸中ROS水平的減少具有統計學差異。而白藜蘆醇的補充卻并沒有使大鼠任何部位的ROS水平有降低。MDA（丙二醛）是一種能夠指示因ROS引起的生物膜損傷的醛類物質。只補充了芥子酸或白藜蘆醇的大鼠在肝臟和結腸中的MDA水平都有降低，但在血漿中的MDA水平卻沒有改變，不過同時補充了兩種酚類物質的大鼠肝臟、結腸和血漿中MDA水平的降低效果要比單獨補充芥子酸和白藜蘆酸的效果更好。補充了芥子酸的大鼠肝臟中的總抗氧化能力（T-AOC）得到了增強，但是血漿和結腸中的T-AOC卻沒有改善（表3）。
表3 各組小鼠肝臟、血漿和結腸中的抗氧化能力指標
4. 白藜蘆酸與芥子酸對腸道菌群的調節
每組大鼠腸道菌群的Alpha多樣性指數如圖2a所示，HF組的OTU數目最少，而HFR和HFS組的OTU數較多，HFR、HFS、HFC這三組大鼠腸道菌群的Chao1和ACE指數都高于HF組大鼠，HFS組的豐度指數也高于HFR和HFC組，但每個組的Shannon指數與Simpson指數卻沒有差異。在菌群組成上，CT組大鼠的菌群與HF組大鼠明顯區別開來，而HFS組的菌群也單獨聚集，和HF組區分開來。HFR組的所有樣本和HFC組的四個樣本在聚類樹上聚在一起。圖2b的聚類樹與圖2c基于Unweighted UniFrac距離的NMDS分析都表明，相較于HFR組，HFS組大鼠糞便中的菌群和CT組更相近。
圖2 各組大鼠腸道菌群的多樣性和組成結構
在大鼠腸道菌群的主要細菌類群方面，門水平上，所有實驗組中大鼠腸道里的細菌類群主要屬于厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes），且高脂飲食使HFC組中的厚壁菌門細菌遠多于HF或CT組，而每組樣本中的擬桿菌門與變形菌門細菌（Proteobacteria）的豐度卻并沒有差異。HFR組中，厚壁菌門與擬桿菌門的相對比率要高于CT組與HF組。HFS和HFC組的柔膜菌門（Tenericutes）與放線菌門（Actinobacteria）的相對豐度都要低于HF組。
在科水平的菌群組成上（圖3b），HFS組大鼠的腸道菌群中，Unclassified RF39 family與Erysipelotrichaceae的豐度高于CT組。HFR組中只有很少的S24-7和Peptostreptococcaceae。另外，HFC組中的Lachnospiraceae與Peptostreptococcaceae豐度都高于HF組。
在屬水平上（圖3c），相較于CT組，高脂飲食使HFC組中含有更多的Roseburia，HFR中則含有更多的Unclassified Peptostreptococcaceae。相較于HF組，HFS和HFR組中含有更多的Blautia和Dorea。HFR組中Unclassified Ruminococcaceae的相對豐度高于HFC組。HFC組中Roseburia的的相對豐度也高于HF組。
圖3 不同分類水平上腸道菌群的變化
5. 腸道菌群組成與宿主指標的相關性分析
通過斯皮爾曼相關性分析，研究了在各組大鼠腸道菌群中有差異的物種、多酚的攝食、血漿脂質與氧化應激相關參數之間的關系（圖4）。該分析只保留了至少與兩種生化指標相關的細菌，發現一些細菌與生化指標之間確實存在著相關性，比如葡萄糖和胰島素都和Treponema，Adlercreutzia和Unclassified Coriobacteriaceae呈正相關，和Anaerotruncus呈負相關；血漿NEFA水平和Mucispirillum具有的負相關性，但同時也和Unclassified Flavobacteriaceae科的一個屬呈正相關關系；甚至有十種以上的細菌類群和血漿TG具有的正相關關系。另外，Moraxellaceae科中的一個未分類細菌類群與Pseudomonas都和HDL-c呈負相關。在酚類物質方面，HFS大鼠腸道菌群中豐度較高的類群有Coriobacteriia，Clostridia和Erysipelotrichi、Bacilli、Gammaproteobacteria classes（Coprobacillus、SMB53、Coriobacteriaceae、Adlercreutzia、Pseudomonas和Streptococcus），而HFR大鼠腸道菌群中豐度較高的類群卻是Blautia、Anaerotruncus、Sutterella和Bilophila，這些類群與Adlercreutzia和Coriobacteriaceae中的一個未分類類群與大鼠三種組織中的MDA值都具有正相關性。Actinomyces則和結腸與肝臟中的ROS水平都呈負相關。
圖4 屬水平上有差異的物種、多酚的攝入、血漿脂質與氧化應激相關參數之間的斯皮爾曼相關性分析
總結
本文通過研究不同飲食策略下大鼠腸道微生物菌群的變化，探究了白藜蘆醇、芥子酸，以及這兩種酚類物質的混合物對高脂飲食引起的腸道菌群紊亂的影響，并得到以下結論：
①白藜蘆醇的使用降低了HFD大鼠的空腹血糖水平，增加了高密度脂蛋白膽固醇（HDL-c）水平；②芥子酸的攝入降低了HFD大鼠結腸中的活性氧簇與丙二醛水平，肝臟中的總抗氧化力也增加；③多酚的攝入，會通過提高產丁酸細菌（Lachaospiraceae科中的Blautia和Dorea）的比例，并抑制與疾病和炎癥有關的細菌（如擬桿菌和脫硫弧菌）的生長，在不同分類水平上都影響到了腸道菌群；④斯皮爾曼相關性分析顯示，某些氧化應激的改變與腸道菌群的改變有直接相關性。
本研究的測序和數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
文章索引：
Chen Yang, Qianchun Deng, Jiqu Xu, et al. Sinapic acid and resveratrol alleviate oxidative stress with modulation of gut microbiota in high-fat diet-fed rats. Food Research International. 2018.
原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0963996918307890
