2018-10-30
系統性紅斑狼瘡（SLE）是一種自身免疫疾病，其特征在于產生針對各種自身抗原的自身抗體。以往的大量研究探討了其發病機制，包括環境，遺傳和激素因素，如紫外線（UVB），維生素D缺乏，病毒，DNA低甲基化microRNAs（miRNAs）的異常表達， 但是對SLE中CircRNA的表達譜和功能研究很少。
CircRNA作為天然miRNA海綿可抑制miRNA的相關活性，在許多疾病的發生和發展中起著重要作用。且閉合環狀的CircRNA比miRNA具有更高的穩定性，被認為是比miRNA更好的生物標記。那么CircRNA是否參與了SLE的發病機制，以及CirRNA與SLE中DNA甲基化水平的關系也就很值得去研究和探討。
接下來與大家分享的是一項研究SLE患者CD4+ T細胞中circRNA的研究結果。在這篇文章中，作者以circRNA表達譜結果為基礎，通過RT-PCR、western blot、小干擾RNA轉染、熒光素酶報告基因和FISH等技術手段篩選并確認了SLE中hsa_circ_0012919的生物標志物功能，明確了hsa_circ_0012919是miR-125a-3p的ceRNA。
? CD4+ T細胞中CircRNA表達譜分析篩選潛在的候選生物標志物
表達譜分析在SLE患者組獲得了12個上調和2個下調的CircRNA，其中在SLE患者組中上調的3種CircRNA可能是潛在的候選生物標志物，包括hsa_circ_0012919，circ_0006239和hsa_circ_0002227。RT-PCR實驗驗證了3種CircRNA的表達情況，結果顯示在健康對照組與SLE患者之間的差異有統計學意義(圖1A-C)。
圖1 三種CircRNA的表達情況
? 在SLE中的診斷潛力確認hsa_circ_0012919是潛在生物標志物
通過比較健康對照，無活動和活動性SLE患者中三種CircRNA的表達，發現hsa_circ_0012919和hsa_circ_0006239表達在活動性SLE患者中高于無活動的SLE患者和健康對照，而健康對照與無活動SLE之間無顯著差異（圖1D，E）。在有關節炎，狼瘡性腎炎，抗dsDNA（+），抗Sm（+），C3或C4缺乏的SLE患者中hsa_circ_0012919表達更高，潑尼松藥物治療后hsa_circ_0012919表達降低。這進一步確認了SLE中的hsa_circ_0012919可被視為SLE的潛在生物標志物。
? hsa_circ_0012919下調對DNMT1，CD11a和CD70表達的影響
在SLE患者的CD4+ T細胞中hsa_circ_0012919和DNMT1的表達之間存在強烈的負相關，與CD70的表達之間呈正相關。hsa_circ_0012919和siRNA-NC特異的小干擾RNA轉染SLE患者的CD4+ T細胞，與siRNA-NC組相比，DNMT1的mRNA和蛋白表達在無活性和活性SLE患者中顯著增加（圖2），相反，與siRNA-NC組相比CD11a和CD70的mRNA和蛋白表達顯著降低。
圖2 hsa_circ_0012919下調對DNMT1，CD11a和CD70表達的影響
? hsa_circ_0012919下調和DNMT1對CD11a和CD70 DNA甲基化的影響
為了確定hsa_circ_0012919是否參與SLE患者的DNA甲基化，分析了兩個基因（CD11a和CD70）的DNA甲基化水平與hsa_circ_0012919表達之間的相關性，并在hsa_circ_0012919的表達和CD11a、 CD70的DNA甲基化水平之間觀察到強烈的逆相關。另外，小干擾RNA轉染實驗表明hsa_circ_0012919的下調逆轉了SLE的CD4+ T細胞中CD11a和CD70的DNA低甲基化，但這種作用可以通過DNMT1靶向的siRNA逆轉。
? Hsa_circ_0012919通過miRNA-125a調節KLF13和RANTES
CircRNA的主要作用之一是結合miRNA以調節基因的表達。為了探究hsa_circ_0012919可以隔離哪些miRNA，生物信息學使用了hsa_circ_0012919的網絡分析。然后我們利用公共數據庫circbases和RNA22V2篩選靶向miRNA，結果顯示miR-125a-3p，miR -6829-3p和miR-1237-5p具有與hsa_circ_0012919的結合位點（圖3）。熒光素酶篩選試驗鑒定了miR-125a-3p。狼瘡CD4+ T細胞中的FISH分析進一步證明了hsa_circ_0012919和miR-125a之間的相互作用（圖3）。后續發現hsa_circ_0012919和miR-125a在細胞質中共定位，這表明hsa_circ_0012919與miR-125a結合。
圖3 hsa_circ_0012919靶向miR-125a
已有研究結果顯示miRNA-125a可以調節RNATES，KLF13和miR-125a-3p可作為miRNA-125a的活性片段起作用，因此假設hsa_circ_0012919通過海綿miR-125a-3p調節RNATES和KLF13。首先，實驗中發現hsa_circ_0012919與狼瘡CD4+ T細胞中RNATES和KLF13的表達呈負相關。然后PCR和Western印跡顯示miR-125a-3p降低RNATES和KLF13的表達，并且hsa_circ_0012919逆轉并增加表達RNATES和KLF13。為了證明hsa_circ_0012919和miR-125之間的直接關系，進行劑量依賴性方式實驗。結果顯示RNATES和KLF13表達以劑量依賴性方式受miR-125和hsa_circ_0012919的影響。
參考文獻
Zhang C, Wang X, Chen Y, et al. The downregulation of hsa_circ_0012919, sponge for miR-125a-3p, contributes to DNA methylation of CD11a and CD70 in CD4+ T cells of SLE[J]. Clinical Science, 2018: CS20180403
原文鏈接：http://www.clinsci.org/content/early/2018/09/20/CS20180403.long
