2018-10-27
文案 | 微生物組事業部
正文
近期，派森諾生物與西北農林科技大學合作，在《Bioresource Technology》（影響因子5.807）發表論文，通過研究優勢和稀有微生物亞群的群落組成和功能特征，揭示無機碳（IC）對氨氧化顆粒系統中優勢和稀有微生物類群的影響。
研究背景
在氨氧化顆粒系統中，氮轉化微生物在氮循環網絡中起著舉足輕重的作用，其中無機碳（IC）作為化學自養微生物同化作用的碳源，在維護氨氧化顆粒系統的穩定中有著十分重要的影響。然而，無機碳對氨氧化顆粒系統中優勢和稀有微生物類群的組成模式和功能概況的影響，目前仍知之甚少。
研究目的
1. 探究在不同IC/TN比值脅迫下，優勢和稀有亞群是否呈現出對比鮮明的組成模式和功能特征；
2. 在分類水平和代謝功能上了解兩個亞群的特點和背后的驅動力；
3. 明確不同細菌亞群中氮轉化途徑的關鍵調控因子。
研究方法
測序技術：Illumina MiSeq高通量測序平臺
測序模式：微生物組細菌16S rRNA基因V3V4區測序
實驗對象：厭氧氨氧化污泥顆粒反應器?
實驗設計
在為期200天的試驗周期中，對厭氧氨氧化顆粒系統分9個階段施加IC（無機碳），形成各時期不同的IC/TN（無機碳/總氮）比值。取各階段結束時的污泥樣本，每個階段取3個重復，并將其混合進行總DNA的提取。DNA用于測序分析和氨氧化功能基因的絕對定量分析。
分組 | 處理 |
Phase Ⅰ | 正常狀態 |
Phase Ⅱ | 不添加IC |
Phase Ⅲ | IC/TN比值0.31 |
Phase Ⅳ | |
Phase Ⅴ | IC/TN比值0.62-1.24 |
Phase Ⅵ | |
Phase Ⅶ | |
Phase Ⅷ | IC/TN比值增至1.87 |
Phase Ⅸ |
研究結果
? 無機碳處理下厭氧氨氧化顆粒系統的氮轉化效率
圖1總結了IC對氨氧化顆粒系統氮處理能力的影響。在階段1（0-20天）中，氮加載速率（NLR）和氮清除速率（NRR）分別為0.88和0.74 kg-N/(m 3 ·d)。ΔNO 2 ? /ΔNH 4 + 和ΔNO 3 ? /ΔNH 4 +的比值分別為1.26 ± 0.02和0.25 ± 0.04。之后，其他階段進行不同濃度的IC處理。
在階段2中，不施加IC處理，NH 4 + -N、NO 2 ? -N和TN的清除效率分別降低至70.83 ± 1.50%、84.43 ± 2.42 %和74.16 ± 1.41%。ΔNO 2 ? /ΔNH 4 +比值上升至1.33 ± 0.03，但ΔNO 3 ? /ΔNH 4 +的比值下降為0.11 ± 0.03。NH 4 + -N、NO 2 ? -N在出水流中能被觀察到。NLR和NRR大幅下降至0.35 和0.26kg-N/(m 3 ·d)。這表明IC不足對氨氧化活性有不良影響。在階段3和階段4中，隨著IC/TN的比值由0升至0.31，NH 4 + -N、NO 2 ? -N和TN的清除效率均逐漸開始回升。這說明厭氧氨氧化菌的活性可以通過施加IC來恢復。
在第5、6、7階段中，IC/TN比值繼續從0.62增加至1.24，NH 4 + -N、NO 2 ? -N和TN的清除效率較大幅度下降，而NLR和NRR只有輕微地減小，表明盡管厭氧氨氧化活性在較高的IC/TN比值（0.62-1.24）下稍稍被抑制，但氨轉化微生物開始逐漸適應新環境。在階段8和9中，IC繼續增加，IC/TN比值升至1.87。NH 4 + -N、NO 2 ? -N和TN的清除效率又開始回升，NLR和NRR也得到恢復。表明更高比值的IC/TN有助于氨氧化顆粒系統的恢復。
圖1：脫氮性能的表現：（a）進水和出水NH4+-N、NO2?-N和NO3?-N的濃度分布；（b）NH4+-N、NO2?-N 和TN的清除效率分布；（c）NH4+-N、NO2?-N 、NO3?-N和TN的轉化速率分布；（d）氮加載速率（NLR）、氮清除速率（NRR）和水力停留時間（HRT）。
? 優勢和稀有亞生物群落組合模式和功能特征
在整個群落中，階段3、5、8的Alpha多樣性與其他階段有顯著差異（P<0.05），表明在以上階段IC/TN比值對細菌群落的均勻度和優勢度有不同的影響。優勢、瞬態和稀有類群包括507、264和1337個OTU，分別占總OTU數的24.1%、12.5%和63.4%。此外有208個OUT屬于核心分類單元，占總數的9.8%。核心分類單元隸屬于優勢和瞬態類群為主，分別占核心分類單元的43.3%和56.7%，而稀有類群在核心分類單元的占比為0。
從分類水平上來看，優勢和稀有類群的細菌群落結構差異很大（2a，b）。Proteobacteria（30.6%）、Chloroflexi（15.7%）、Bacteroidetes（12.5%）、WWE3（12.1%）和Planctomycetes（9.5%）為優勢亞群中占主導地位的門，而Proteobacteria（35.4%）、Actinobacteria（17.9%）、Acidobacteria（12.6%）、Chloroflexi（12.4%）和Bacteroidetes（5.1%）為稀有亞群中的有勢門。Wilcoxon秩和檢驗結果表明，優勢亞群落與稀有亞群落在IC/TN比值脅迫下組成模式存在顯著差異（P<0.05）。
優勢和稀有亞群的功能預測和代謝途徑分析結果顯示前21種代謝途徑為上述兩種細菌亞群所共享。氨基酸利用代謝、轉運體、核酸代謝、細胞應激反應和氮循環為主要功能模塊（圖2c，d）。其中與氨基酸利用代謝、細胞應激反應和氮循環相關的功能模塊在優勢亞群中更為普遍。相反，與轉運體和核酸代謝相關的功能模塊在稀有亞群中更加優勢。Wilcoxon秩和檢驗表明，優勢亞群和稀有亞群在功能分布上存在顯著差異（P<0.05）。
圖2：不同處理階段優勢門和功能性狀在優勢和稀有亞群中的分布。每條帶的厚度表示對應分類單元的豐度。內段的絕對厚度和外段的相對厚度分別代表每個分類單元的絕對豐度和相對豐度。其他代表未鑒定的序列。數據由Circos進行可視化（Version 0.69，http://circos.ca/）。
? 共現網絡的拓撲和分類學特性
為了確定不同細菌亞群的共生模式，本研究構建了群落組成和功能特征的子網絡。在OTU共現分析中，整個網絡關系1712個節點共捕獲了72179個邊緣（Spearman’s |ρ|≥0.8，P < 0.01）。在這些節點中，385個屬于優勢亞群子網絡，1296個屬于稀有亞群子網絡（圖3a，b），表明稀有亞群比優勢亞群有更高的共現實例。與此同時，子網絡的拓撲特征如介度、貼近度、節點可及性、節點度等，在優勢亞群和稀有亞群之間存在差異（圖3c-e）。如圖3c所示，優勢亞群和瞬態亞群的節點間中心性值較高，表明整個網絡中存在優勢類群的核心位置。相反，低介中心性值表明稀有類群具有外圍分布。此外，與優勢亞群相比，稀有亞群具有更高的貼近度、節點可及性和節點度，表明稀有亞群的類群內關聯更強。
圖3：網絡分析揭示了OTUs的共現模式。節點分別根據不同的模塊分類著色（a，b）。連接代表強大（斯皮爾曼相關系數ρ > 0.8 或者 ρ < -0.8）和顯著（P<0.01）的相關性。每個節點的大小與OTUs的豐度成正比。不同亞群的節點級拓撲特征命名為betweenness（c）、closeness（d）、transitivity（e）和degree (f)。AT、MT和RT分別表示優勢分類群、瞬態分類群和稀有分類群。
? 優勢和稀有亞群的驅動力
為探究環境和物種的顯著相關性，本研究建立了斯皮爾曼相關性網絡（圖4）。通常細菌亞群的群落組成和功能特征受到不同環境因子的制約。在環境-物種關聯網絡中，環境變量如出水流中的NO3?-N、NO2?-N和NH4+-N與優勢亞群相關的屬之間有顯著相關性，其他環境變量如IC/TN比值和TN清除率顯示相對較弱的相關性（圖4a）。對于稀有亞群，環境變量如NH4+-N、NO2?-N和TN清除率和選中的屬有更緊密的關聯性（圖4b）。在環境-功能關聯網絡中，與脫氮相關的功能模塊主要與出水流的NO3?-N、NH4+-N、NO2?-N和TN清除率相關，并在優勢和稀有亞群中均表現出正相關。然而，結果表明其他功能特征和環境變量之間的正負相關性在兩個亞群中普遍不同（圖4c，d）。這些結果表明，優勢和稀有亞群是由不同的操作變量控制的。
圖4：基于相關分析的優勢屬、功能性狀和環境變量的網絡分析。圖中只顯示斯皮爾曼系數ρ > 0.6 或ρ < ?0.6且顯著相關（P<0.05）的關系。每個節點代表優勢屬或功能特征的相對豐度。菱形節點代表環境變量。實線表示正相關，虛線表示負相關。每條線的厚度與所相連的相關性系數成正比。
? 氮代謝特征與功能屬的適應性
針對厭氧氨氧化通路，通過KEGG數據庫預測發現，在第4、7和9階段，c-di-GMP 的含量遠高于其他階段。與硝酸鹽同化作用相關的功能基因nasA、nasB 和nirA在稀有亞群落中比在優勢亞群落中更為優勢；與反硝化相關的功能基因nosZ、qnorB 和nirS 在優勢亞群中的豐度高于稀有亞群；與硝酸鹽分解相關的功能基因napA 和nrfA 在稀有亞群中的預測豐度更高（圖5a，c）。這些結果表明氮轉化如反硝化、硝化和固氮作用受到優勢亞群的調節，而同化硝酸鹽還原和異化硝酸鹽還原成銨主要受到稀有亞群的調控。
由于氨氧化顆粒反應器的工藝性能受到多種功能物種的介導，本研究基于MiDAS數據庫對結構-功能關系進行了預測分析（圖5b，d）。在所有經過過濾的屬中，對核心功能屬（相對豐度最高的12個分類群）為優勢或稀有亞群進行了注釋。MiDAS數據庫顯示這些功能物種包含8個功能類群，分別是氨氧化細菌（AOB）、亞硝酸鹽氧化菌（NOB）、厭氧氨氧化菌、異養微生物（HET）、磷酸鹽積累生物（PAO）、糖原積累生物（GAO）、亞硝酸鹽還原菌（NIR）和硝酸鹽還原菌（NAR）。如圖5b和 d所示，較低的IC/TN比值有利于AOB和Candidatus Brocadia 生長，而適中的IC/TN比值（0.62-1.24）有助于NOB、HET和Candidatus Jettenia 生長，特別的是Candidatus Kuenenia 和GAO能夠在更高比值的IC/TN（1.56-1.87）脅迫下生長。由此可見這些氨氧化相關的微生物在IC脅迫下有著不同的適應性。
圖5：由Tax4Fun基于KEGG數據庫對參與微生物氮循環預測得到的功能基因（a和c）；基于MiDAS數據庫分析得到的與硝基環化相關功能屬在優勢和稀有亞群中的分布（b和d）。POS和NEG分別代表正相關和負相關。
為了證實MiSeq的測序分析結果，研究者對氮轉化相關的功能基因進行了定量分析（圖6）。該結果表明優勢亞群是NH4+-N和NO2?-N消耗的關鍵調控因子，而稀有亞群主要負責NH4+-N和NO2?-N的積累。這些結果表明氮轉化途徑是由不同的細菌亞群介導，此外在不同的IC處理條件下，細菌亞群有不同的生存策略。
圖6：不同時期氮功能基因的定量分析。誤差線代表由3個獨立重復實驗得到的標準差。
總結
本研究結果表明，優勢和稀有亞群在IC/TN脅迫下表現出不同的組合模式和功能特征，而該功能特性決定了細菌亞群的選擇。細菌亞群在IC脅迫下的生態策略與環境變量密切相關。此外，較低的IC/TN比值（<0.31）對AOB和Candidatus Brocadia 有益，中等的IC/TN比值（0.62-1.24）對NOB、HET和Candidatus Jettenia 較為有利，而Candidatus Kuenenia 和GAO更偏好于較高的IC/TN比值（1.56-1.87）。最后qPCR結果證實在不同程度的IC處理條件下氮轉化網絡受到不同細菌亞群的調節。
本研究的測序工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
文章索引
Duntao Shu et al. Abundant and rare microbial sub-communities in anammox granules present contrasting assemblage patterns and metabolic functions in response to inorganic carbon stresses. Bioresource Technology 265 (2018):299–309.
