2018-10-11
正文
最近，派森諾生物與華中農業大學合作，在土壤學期刊《Soil Biology & Biochemistry》（影響因子4.926）再次發表論文，利用高通量測序技術，研究不同施肥方法處理26年后，土壤中亞硝酸鹽氧化細菌（NOB）的群落結構變化，探究長期的施肥活動，對硝化螺菌與硝化桿菌類NOB群落的生態影響。
研究背景
硝化作用是氮循環中至關重要的環節，亞硝酸鹽氧化細菌（NOB）是硝化作用第二階段的關鍵菌群，它們廣泛分布在α-、β-、γ-，和 δ-變形菌門與硝化螺菌中。
由于亞硝酸鹽通常不會在環境中有所積累，由氨氧化古菌（AOA）與氨氧化細菌（AOB）介導的氨氧化反應通常被認為是硝化作用的限速步驟，事實上，由NOB介導的亞硝酸氧化作用在受到干擾的土壤系統中也能成為硝化作用的限速步驟。
近年來，許多研究都聚焦于土壤環境中AOA與AOB的生態功能上，而農業生態系統中，NOB對環境干擾（如農業土壤中不同的施肥方法）的生態學響應，NOB菌群和農業土壤中亞硝酸氧化反應活動的聯系，以及NOB群落對土壤pH改變的響應仍知之甚少，亟待解決。
研究目的
1. 研究不同施肥方法處理26年后，各土壤中硝化螺菌與硝化桿菌類NOB菌群的豐度、多樣性和群落組成；
2. 研究長期的施肥活動對硝化螺菌與硝化桿菌類NOB群落的生態影響。
研究方法
測序技術：Illumina MiSeq PE300
測序模式：nxrA、nxrB功能基因測序
實驗對象：不同施肥方法處理26年后的土壤樣品
實驗設計：于1990年建立長期的施肥實驗，實驗地點的種植方式為：冬小麥（Triticum aestivum L.）-夏玉米（Zea mays L.）。在實驗地點中，一共設有如表1所示的四種施肥方式，其中，NPK組的土壤有嚴重酸化現象。2016年11月，在每個樣地中選取6個取樣點，于0~20 cm深處取樣后，將6個樣點的樣品混勻作為該樣地的樣品。采集的樣品，一部分用于微生物測序與qPCR實驗，一部分用于測定土壤中的理化性質。
表1 施肥方式
研究結果
1. 土壤理化性質
不同施肥方式處理26年后，土壤的理化性質如表2所示，不同處理后的土壤pH值存在顯著差異，CK組與M組中的pH值要高于其它組，NPK組的pH值（4.83）最低。同時，所有處理組的TC、TN和SOC含量也具有顯著差異，其中，M組中TC、TN和SOC的含量最高，而CK組中NO3-的含量在所有組中最低。不過，土壤中氨的含量在不同的施肥處理下仍相差不大。
表2 土壤理化性質
2. 土壤中的潛在亞硝酸鹽氧化活性（PNO）
土壤的PNO值在0.07 ~ 0.37 μg NO2?-N kg?1 dry soil h?1之間。相較于不施肥的CK組，施肥各組中的PNO值都有顯著增高。ANOVA分析也顯示，土壤中的PNO值受到了施肥處理的顯著影響（P<0.01），同時，PNO與土壤NO3?、TC 、TN和SOC之間都呈正相關。
圖1 各種施肥處理的土壤中的PNO值
3. 硝化桿菌和硝化螺菌類NOB的豐度
通過nxrA、nxrB基因的拷貝數衡量了硝化桿菌與硝化螺菌的豐度，結果顯示，硝化桿菌的豐度在MNPK組中最高，而硝化螺菌的豐度在CK組中最高，且顯著高于各施肥處理組。同時，nxrB/nxrA基因拷貝數的比率在7.6 ~ 168.2之間，其中，比率最高的是CK組，其次是NPK、MNPK和M組，這表明，施肥處理對nxrB/nxrA基因拷貝數的比率有顯著的消極影響。另外，除了NPK以外的其它組中，PNO與硝化桿菌的nxrA拷貝數都有很高的正相關性，與硝化螺菌的nxrB拷貝數卻沒有相關性，不過，PNO與nxrB/nxrA豐度的比例卻有著很強的負相關性。
圖2 不同施肥處理下，NOB的豐度
4.硝化桿菌與硝化螺菌類NOB的群落結構
利用高通量測序技術，實驗共得到了678,665條高質量nxrA序列（2878 OTU）與370,887條高質量nxrB序列（3243個OTU）。在菌群多樣性上，硝化桿菌類NOB的ACE與Chao1指數在每種處理間沒有顯著差異，但M組中的Shannon與Simpson指數要明顯高于其它組；硝化螺菌類NOB的Shannon與Simpson多樣性指數則是在MNPK和M組中最高，其次是CK與NPK組。
Anosim分析顯示，施肥方法是能顯著影響NOB群落的驅動因子，且在NMDS分析中，每種施肥處理下的硝化桿菌和硝化螺菌類NOB的菌群都各自聚在一起，與其它不同施肥處理的樣品分離開來，其中，NPK組的硝化桿菌與硝化螺菌類NOB與其它各組之間差異最大。
圖3 不同施肥處理土壤中，NOB菌群的NMDS分析
5. NOB群落組成與環境變化之間的關系
RDA分析顯示，在所有的環境因素中，土壤pH值是影響硝化桿菌與硝化螺菌類NOB群落組成的最主要因素，同時，土壤SOC與TN含量也分別能在較大程度上影響硝化桿菌與硝化螺菌類NOB的群落組成。
圖4 NOB菌群與環境因素相關性的RDA冗余分析
MRT分析顯示，土壤pH值是NOB相對OTU豐度的強預測因子，硝化桿菌與硝化螺菌類NOB群落中，低pH水平的樣品（NPK組）聚在了一起，與高pH水平的樣品分離開來。同時，基于MRT分析結果的一般線性模型表明，在低pH值下，有四個硝化桿菌OTU與1個硝化螺菌OTU的豐度有顯著增加，但也有7個硝化桿菌OTU與10個硝化螺菌OTU的豐度有顯著降低，還有一個硝化螺菌OTU沒有受到pH值的顯著影響。
圖5 不同施肥處理下，主要OTU（相對豐度>1%）的相對豐度與土壤性質的MRT分析，以及主要OTU的相對豐度對土壤pH值的響應
6. NOB的豐度、多樣性和組成在預測PNO上的重要度
自動線性模型分析顯示，nxrB/nxrA的豐度比率是PNO的最佳預測指標，解釋率高達69%，而nxrB和nxrA的豐度，分別只有23%與8%的解釋率。這表明，土壤中PNO的改變是通過硝化螺菌/硝化桿菌的豐度比率介導的。同時，硝化桿菌的Chao1和ACE指數也展現出對PNO的強烈影響，其次是硝化螺菌的ACE指數與硝化桿菌的Shannon指數。在NOB的群落結構方面，硝化桿菌是預測PNO最重要的指標，而硝化螺菌對PNO的預測作用則相對較弱。
圖6 自動線性模型分析下，NOB的豐度、多樣性和組成在預測PNO上的重要度
總結
本文利用高通量測序技術，結合qPCR技術與土壤理化性質檢測技術，研究了不同施肥方式處理26年后的土壤中亞硝酸鹽氧化細菌（NOB）的群落結構變化，探究了長期的施肥活動，對硝化螺菌與硝化桿菌類NOB群落的生態影響，并得到以下結果：①硝化桿菌的豐度在M、MNPK組中顯著增加，而硝化螺菌的豐度在M、NPK組中顯著減少，在MNPK中的含量也非常少；②硝化桿菌的多樣性在M組中增加，硝化螺菌的多樣性在M與MNPK組中均有增加，但在NPK組中減少了；③NMDS分析顯示，硝化螺菌與硝化桿菌群落在四種施肥處理下均發生了轉變；④冗余分析顯示：pH+SOC和pH+TN顯著解釋了硝化桿菌與硝化螺菌類NOB群落組成的變化；⑤土壤PNO的改變與硝化螺菌/硝化桿菌的豐度比率和它們的群落結構有關。這些結果表明，土壤中的亞硝酸鹽氧化過程可能同時受到亞硝酸桿菌、亞硝酸螺菌這兩種亞硝酸鹽氧化菌的控制，而亞硝酸螺菌與亞硝酸桿菌分別又受到pH+TN和PH+SOC的限制。
本研究的測序和數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
文章索引：
Shun Han, Luyang Zeng, Xuesong Luo, Xiang Xiong, Shilin Wen, Boren Wang, Wenli Chen, Qiaoyun Huang, Shifts in Nitrobacter- and Nitrospira-like nitrite-oxidizing bacterial communities under long-term fertilization practices, Soil Biology and Biochemistry, Volume 124, 2018, Pages 118-125.
原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0038071718301895
