2018-09-13
正文
最近，派森諾生物與南京農業大學合作，在《Soil Biology & Biochemistry》（影響因子4.926）再次發表論文，利用高通量測序技術，研究不同施肥方法處理35年后，土壤中氨氧化菌群的群落結構與功能變化，揭示AOA、AOB對硝化作用的相對貢獻度，探究影響氨氧化菌組成、豐度、多樣性與活性的主要環境驅動因子。
研究背景
硝化作用是氮循環中至關重要的有氧環節，不僅影響著陸生生態系統中N的命運，還會促進土壤中一氧化二氮的釋出與硝酸鹽的淋溶。硝化作用中關鍵的一步——氨氧化反應，便主要由氨氧化古菌（AOA）與氨氧化細菌（AOB）介導。
在目前的農業生產中，人們經常施肥以改善植物營養狀況，實現高產，但這同時也對土壤環境產生了強烈影響。目前的研究顯示，AOA與AOB的群落結構主要受土壤pH和氨/銨比影響，而土壤中氨氧化菌群落的活性、豐度、多樣性和組成，則會受到土壤鹽分、有機碳、碳/氮比、溫度和土壤質地的影響。這些研究讓我們對氨氧化過程和氨氧化菌對環境變化的響應過程有了更多了解，但是，在自然環境，尤其是受到人為干擾的環境中，這些土壤因子對氨氧化菌群落的影響程度還不清楚，AOA與AOB對土壤硝化作用的相對貢獻度問題也仍未得出結論。
氨氧化菌對生態系統非常重要，研究長期的不同施肥策略對氨氧化菌的活性、豐度、多樣性和組成的影響，探究能驅動AOA與AOB生態功能的環境因子，對改善農業用地中硝酸鹽的管理策略具有重要意義。
研究目的
2. 探究影響氨氧化菌群結構的主要環境驅動因子。
研究方法
測序技術：羅氏454焦磷酸測序平臺
測序模式：AOA、AOB功能基因（amoA基因）測序
實驗對象：不同施肥策略處理35年后的土壤樣品
實驗設計：于1981年選定實驗地點，測定土壤中的理化性質，隨后在該實驗地點隨機選取20個30 m2大小的樣地，按照表1所示的五種處理方式開展實驗，2016年3月，在每個樣地中選取6個取樣點，于0~20 cm深處取樣后，將6個樣點的樣品混勻作為該樣地的樣品。采集的樣品，一部分用于微生物測序，一部分用于測定土壤中的理化性質，同時設計1-Octyne（1-辛炔）實驗區分AOA與AOB的氨氧化活動。
表1 不同樣地的處理方式
處理方式 | 重復數 | |
Control | 不施肥 | 4 |
NPK | 只施NPK化肥 | 4 |
O | 只施有機肥 | 4 |
NPKO | NPK化肥與有機肥都施 | 4 |
HNPKO | 施高濃度的NPK化肥與有機肥 | 4 |
研究結果
1. 硝化勢
不同施肥策略處理后的土壤硝化勢顯著不同，其中，只施有機肥的土壤具有最高硝化勢（44.49 mg N kg-1 soil d-1），而只施NPK肥的土壤，硝化勢最低（20 mg N kg-1 soil d-1）。不過，相較于對照組，O組與NPKP組土壤的硝化勢分別增加了359.51%與140.25%，而NPK組與HNPKO組卻分別減少了71.01%和35.51%。
圖1 不同施肥策略下土壤的硝化勢變化
2. AOA與AOB中amoA基因的豐度
①每克干土壤樣品中，AOA中的amoA序列數為1.07×107~2.78×107拷貝數，AOB中的amoA序列數為5.67×105~2.72×107拷貝數；同時，AOA/AOB的amoA序列數比率在對照組中最高（46.67），O組最低（1.03），相較于對照組，AOA的豐度在NPK組和HNPKO組的土壤中顯著減少了52.89~61.40%，而在O組與NPKO組中，AOA的豐度顯著增高了6.72~16.77%；而土壤中AOB的amoA基因豐度，卻在所有的施肥策略下都顯著增加；
②AOA與AOB中amoA的序列數都和總的土壤硝化勢呈正相關；
圖2 不同施肥策略下AOA與AOB amoA基因的序列數
③辛炔敏感型的硝化勢，指數式（exponentially）依賴于AOB的amoA基因序列數，而耐辛炔的硝化勢卻和AOA的amoA基因序列數呈顯著的線性相關。
圖3 耐辛炔（AOA）、辛炔敏感型（AOB）的硝化勢指數與對應amoA基因序列數的關系
3. AOA與AOB的群落組成與多樣性
①測序結果顯示，土壤中AOA的物種多樣性要高于AOB，同時，不同施肥策略下，土壤中AOA和AOB的群落多樣性都出現了顯著差異。這主要表現在，AOA的Shannon指數在對照組中最低，在NPKO組與HNPKO組中最高，而AOB的Shannon多樣性指數在O組中最高，在其它四個組之間卻沒有出現顯著差異；
②基于Bray-Curtis距離對土壤中的AOA與AOB群落進行PCoA分析后發現，不同施肥策略的土壤中存在的AOA或AOB群落之間出現了分離的現象，其中，NPK組土壤中的AOA群落與其它組的AOA群落明顯分離，而NPKO與HNPKO兩組的AOA群落聚集在了一起，對照組也和O組聚集在了一起。AOB群落則主要分為了三部分，NPK、NPKO和HNPKO組的AOB群落聚在一起，與對照組和O組區別開來。
圖4 土壤中AOA、AOB群落的PCoA分析
③基于優勢AOA、AOB中amoA OTU的進化樹顯示，AOA中的優勢amoA OTU，主要屬于group I.1b lineage（Nitrososphaera），這類OTU也在對照組和O組中占優勢地位，也有部分OTU屬于group I.1a（Nitrosopumilus cluster）和group I.1a-associated lineage （Nitrosotalea cluster），其中，group I.1a的OTU主要出現在NPKO和HNPKO組的土壤中；
圖5 AOA amoA OTU的進化樹（A）與不同施肥策略下各AOA 類群的相對豐度（B）
AOB的優勢amoA OTU幾乎歸屬于Nitrosospira-like屬，并主要聚成了四類，即Nitrosospira cluster 8b、cluster 3a.2、cluster 3a.1和cluster 3b。
圖6 AOB amoA OTU的進化樹（A）與不同施肥策略下各AOA類群的相對豐度（B）
4. 環境因素對氨氧化菌的活性、豐度、多樣性和組成的影響
ABT模型（aggregated boosted tree）顯示，影響AOA活性與多樣性的主要因素是土壤中的銨態氮（NH4+）含量，土壤pH不僅是影響AOA豐度與組成的主要因素，還能強烈影響AOB的硝化勢與多樣性；土壤電導率與銨態氮（NH4+）含量則分別影響了AOB的豐度與組成。
圖7 各種環境因子對氨氧化菌活性、豐度、多樣性和組成的影響
總結
本文通過研究不同施肥策略處理35年后的土壤中氨氧化菌的群落組成，結合土壤中的理化性質，探究不同施肥策略下氨氧化菌的群落結構與功能變化，以及影響氨氧化菌群結構的主要環境驅動因子，并得到以下結論：①只施有機肥的土壤硝化活性最高，只施NPK肥的土壤硝化活性最低；②AOA主導了對照組土壤中的硝化作用，AOB則主導所有有機改良土壤中的硝化作用，而施NPK肥的土壤中AOA與AOB的貢獻率相差不大；③相較于對照組土壤，AOA的豐度在含低濃度NPK肥的有機肥中增加了，但在只有NPK肥的土壤中減少了，而AOB的豐度在所有施肥的土壤中都有顯著增加；④不同施肥策略處理的土壤中氨氧化菌的群落組成有差異；⑤土壤中NH4+的含量是影響AOA活性、多樣性，AOB組成的主要環境因子，土壤pH是影響AOA組成、豐度，AOB活性、多樣性的主要環境因子，而AOB的相對豐度則主要受土壤電導率影響。
本研究的測序和數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
文章索引
Guo J, Ling N, Chen H, et al. Distinct drivers of activity, abundance, diversity and composition of ammonia-oxidizers: evidence from a long-term field experiment[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2017, 115: 403-414.
原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S003807171630520X
